Een vereenvoudigde methode voor het genereren van nierorganoïden uit menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Hier beschrijven we een protocol om nierorganoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s). Dit protocol genereert nierorganoïden binnen twee weken. De resulterende nierorganoïden kunnen worden gekweekt in grootschalige spinnerkolven of magnetische roerplaten met meerdere bronnen voor parallelle medicijntestbenaderingen.
Abstract
Nierorganoïden gegenereerd uit hPSC’s hebben gezorgd voor een onbeperkte bron van nierweefsel. Menselijke nierorganoïden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van nierziekte en -letsel, het ontwikkelen van celgebaseerde therapieën en het testen van nieuwe therapieën. Voor dergelijke toepassingen zijn grote aantallen uniforme organoïden en zeer reproduceerbare assays nodig. We hebben voortgebouwd op ons eerder gepubliceerde nierorganoïde protocol om de algehele gezondheid van de organoïden te verbeteren. Dit eenvoudige, robuuste 3D-protocol omvat de vorming van uniforme embryoïde lichamen in minimaal componentmedium met lipiden, insuline-transferrine-selenium-ethanolaminesupplement en polyvinylalcohol met GSK3-remmer (CHIR99021) gedurende 3 dagen, gevolgd door kweek in knock-out serumvervanging (KOSR)-bevattend medium. Bovendien zorgen agitatietests voor vermindering van het samenklonteren van de embryoïde lichamen en het handhaven van een uniforme grootte, wat belangrijk is voor het verminderen van variabiliteit tussen organoïden. Over het algemeen biedt het protocol een snelle, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het genereren van grote hoeveelheden nierorganoïden.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn een aantal protocollen ontwikkeld om menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in nierorganoïden 1,2,3,4,5. Nierorganoïden hebben een belangrijk hulpmiddel geboden bij het onderzoek naar nieuwe regeneratieve geneeskundebenaderingen, modelleren niergerelateerde ziekten, het uitvoeren van toxiciteitsstudies en de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen. Ondanks hun brede toepasbaarheid hebben nierorganoïden beperkingen zoals gebrek aan rijping, beperkte kweekcapaciteit op lange termijn in vitro en een tekort aan verschillende celtypen in de menselijke nier 6,7,8. Recent werk heeft zich gericht op het verbeteren van het niveau van organoïde rijping, het verlengen van de kweekperioden en het uitbreiden van de complexiteit van niercelpopulaties door de bestaande protocollente wijzigen 9,10,11,12. In deze huidige iteratie van ons vastgestelde protocol 5,13 hebben we de mediumcomponenten in de eerste fase van het protocol gewijzigd in een serumvrij basemedium aangevuld met insuline-transferrine-selenium-ethanolamine (ITSE), lipiden, polyvinylalcohol (E5-ILP) en CHIR99021 (figuur 1). Deze veranderingen zorgen voor een volledig gedefinieerd, serumvrij, eiwitarm medium, met minder componenten dan onze vorige mediumsamenstelling 5,13 en zonder extra groeifactoren. Als gevolg hiervan is het medium van de eerste fase minder arbeidsintensief om voor te bereiden dan onze eerder gepubliceerde versie en kan de batch-tot-batch variabiliteit5 verminderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel insuline als transferrine belangrijk zijn in serumvrije cultuur14,15, maar hoge niveaus van insuline kunnen remmend zijn voor mesodermdifferentiatie16. We hebben de lage insulinespiegels gehandhaafd zoals voorzien in het oorspronkelijke protocol en verder verlaagde niveaus van KOSR (met insuline) in de tweede fase van de test. In overeenstemming met andere protocollen voor de vorming van nierorganoïden, zijn lagere niveaus van KOSR gunstig voor het handhaven van een evenwicht tussen proliferatie en differentiatie van het nierweefsel17. Daarnaast hebben we de glucoseconcentratie in ons Stadium II medium13 verlaagd.
Onze methode beschrijft een opstelling voor suspensietest van nierorganoïden, die tot ~ 1.000 organoïden oplevert van een initiële ~ 60% confluent hPSC 100 mm kweekplaat zoals beschreven in de oorspronkelijke publicatie 5,13. Dit protocol kan eenvoudig worden opgeschaald naar meerdere platen van 100 mm of 150 mm om het aantal organoïden verder te verhogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat de eerste protocolstappen van cruciaal belang zijn voor intermediaire mesodermdifferentiatie 5,19,20 en daarom is het essentieel om in dit stadium een strikte mediumsamenstelling te implementeren. Het verwijderen van ongedefinieerde componenten zoals serum, albumine, eiwitvrij hybridoma medium II uit de eerste fase van het protocol kan helpen om de consistente differentiatie-efficiëntie tus…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 en P30-DK079307 en ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program aan AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
Riferimenti
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
