여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.
hPSCs에서 생성 된 신장 오가노이드는 신장 조직의 무한한 공급원을 제공했습니다. 인간 신장 오가노이드는 신장 질환 및 부상을 연구하고, 세포 기반 치료법을 개발하고, 새로운 치료법을 테스트하는 데 매우 유용한 도구입니다. 이러한 적용을 위해서는 많은 수의 균일 한 오가노이드와 재현성이 높은 분석이 필요합니다. 우리는 오가노이드의 전반적인 건강을 개선하기 위해 이전에 발표 된 신장 오가노이드 프로토콜을 기반으로합니다. 이 간단하고 견고한 3D 프로토콜은 지질, 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 보충제 및 GSK3 억제제(CHIR99021)를 함유한 폴리비닐알코올을 함유하는 최소 성분 배지에서 3일 동안 균일한 배아체를 형성한 다음, 녹아웃 혈청 대체(KOSR) 함유 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 또한, 교반 분석은 배아체의 응집을 줄이고 균일 한 크기를 유지할 수있게하며, 이는 오가노이드 간의 변동성을 줄이는 데 중요합니다. 전반적으로이 프로토콜은 다량의 신장 오가노이드를 생성하기위한 빠르고 효율적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
최근 몇 년 동안, 인간 다능성 줄기 세포를 신장 오가노이드로 분화시키기 위한 다수의 프로토콜이 개발되었다 1,2,3,4,5. 신장 오가노이드는 새로운 재생 의학 접근법에 대한 연구를 돕고, 신장 관련 질병을 모델링하고, 독성 연구 및 치료 약물 개발을 수행하는 데 중요한 도구를 제공했습니다. 그들의 광범위한 적용성에도 불구하고, 신장 오가노이드는 성숙의 부족, 시험관 내에서의 제한된 장기 배양 능력, 및 인간 신장6,7,8에서 발견되는 여러 세포 유형의 소박함과 같은 한계를 갖는다. 최근의 연구는 오가노이드 성숙 수준을 향상시키고, 배양 기간을 연장하며, 기존 프로토콜 9,10,11,12를 수정하여 신장 세포 집단의 복잡성을 확대하는 데 중점을 두었습니다. 확립된 프로토콜 5,13의 이번 반복에서, 우리는 프로토콜의 첫 번째 단계에서 배지 성분을 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민(ITSE), 지질, 폴리비닐 알코올(E5-ILP) 및 CHIR99021로 보충된 무혈청 염기 배지로 변형시켰다(도 1). 이러한 변화는 완전히 정의 된 혈청이없고 저단백질 배지를 제공하며, 이전 배지 조성 5,13보다 성분이 적고 추가 성장 인자가 없습니다. 결과적으로, 첫 번째 단계 매체는 이전에 게시된 버전보다 준비에 노동력이 덜 많으며, 배치-배치 간 변동성을 감소시킬 수 있다5. 이전의 연구들은 인슐린과 트랜스페린 둘 다 무혈청 배양14,15에서 중요하다는 것을 보여주었지만, 높은 수준의 인슐린은 중배엽 분화를 억제할 수 있다16. 우리는 원래의 프로토콜에 제공된 바와 같이 낮은 인슐린 수준을 유지하고 분석의 두 번째 단계에서 KOSR (인슐린 함유)의 수준을 더욱 감소시켰다. 신장 오가노이드 형성을 위한 다른 프로토콜과 일치하여, KOSR의 낮은 수준은 신장 조직의 증식과 분화 사이의 균형을 유지하는데 유익하다(17). 또한, 우리는 우리의 Stage II 배지13에서 글루코스 농도를 낮췄다.
우리의 방법은 신장 오가노이드의 현탁 분석을 위한 셋업을 기술하며, 원래의 간행물 5,13에 기술된 바와 같이 초기 ∼60% 합류 hPSC 100 mm 배양 플레이트로부터 최대 ∼1,000개의 오가노이드를 산출한다. 이 프로토콜은 여러 개의 100mm 또는 150mm 플레이트로 시작하여 오가노이드 수를 더욱 늘릴 수 있습니다.
이전의 연구들은 초기 프로토콜 단계들이 중간 중배 엽 분화 5,19,20에 매우 중요하며, 따라서, 이 단계에서 엄격한 배지 조성물을 구현하는 것이 필수적이라는 것을 보여주었다. 프로토콜의 첫 번째 단계로부터 혈청, 알부민, 단백질 프리 하이브리도마 배지 II와 같은 정의되지 않은 성분을 제거하는 것은 분석(21</…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 국립 보건원 R01 DK069403, UC2 DK126122 및 P30-DK079307 및 ASN 신장 연구 재단 Ben J. Lipps Research Fellowship Program에서 AP에 자금을 지원했습니다.
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |