Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Questo protocollo genera organoidi renali entro due settimane. Gli organoidi renali risultanti possono essere coltivati in fiaschi spinner su larga scala o piastre magnetiche multi-pozzo per approcci paralleli di test antidroga.
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Articolo metodologico
Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi renali generati dalle hPSC hanno fornito una fonte illimitata di tessuto renale. Gli organoidi renali umani sono uno strumento inestimabile per studiare malattie e lesioni renali, sviluppare terapie cellulari e testare nuove terapie. Per tali applicazioni è necessario un gran numero di organoidi uniformi e saggi altamente riproducibili. Abbiamo costruito sul nostro protocollo organoide renale precedentemente pubblicato per migliorare la salute generale degli organoidi. Questo semplice e robusto protocollo 3D prevede la formazione di corpi embrioidi uniformi in un mezzo componente minimo contenente lipidi, integratore di insulina-transferrina-selenio-etanolammina e alcool polivinilico con inibitore GSK3 (CHIR99021) per 3 giorni, seguito da coltura in mezzo contenente siero sostitutivo knock-out (KOSR). Inoltre, i saggi di agitazione consentono di ridurre l'aggregazione dei corpi embrioidi e di mantenere una dimensione uniforme, che è importante per ridurre la variabilità tra gli organoidi. Nel complesso, il protocollo fornisce un metodo veloce, efficiente ed economico per generare grandi quantità di organoidi renali.
Introduzione
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di protocolli per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in organoidi renali 1,2,3,4,5. Gli organoidi renali hanno fornito uno strumento importante per aiutare la ricerca su nuovi approcci di medicina rigenerativa, modellare malattie renali, eseguire studi di tossicità e sviluppo di farmaci terapeutici. Nonostante la loro ampia applicabilità, gli organoidi renali hanno limitazioni come la mancanza di maturazione, la limitata capacità di colt....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che utilizzano hPSC sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati condotti in una cappa di biosicurezza di Classe II con adeguati dispositivi di protezione individuale. Tutti i reagenti sono di grado di coltura cellulare, salvo diversa indicazione. Tutte le colture vengono incubate a 37 °C, 5% CO2 atmosfera atmosferica. In tutte le fasi del test, i corpi embrioidi o gli organoidi renali possono essere raccolti e fissati o preparati per l'analisi. Le linee hPSC utilizzate per generare questi dati sono state completamente caratterizzate e pubblicate18.
1.....
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Risultati
In questa versione più recente del nostro protocollo, la differenziazione degli organoidi renali viene avviata in un mezzo definito a basso contenuto proteico. I saggi vengono eseguiti interamente in sospensione e si basano sulla capacità innata di differenziazione e organizzazione delle hPSC per l'inizio della tubulogenesi. Un singolo test proveniente da una piastra di coltura hPSC confluente da 100 mm ~ 60% produce abitualmente 500-1.000 organoidi renali, come mostrato nella nostra precedente pubblicazione
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Discussione
Studi precedenti hanno dimostrato che le fasi iniziali del protocollo sono fondamentali per la differenziazione del mesoderma intermedio 5,19,20 e, pertanto, è essenziale implementare una composizione media rigorosa in questa fase. La rimozione di componenti indefiniti come siero, albumina, ibridoma medio II privo di proteine dal primo stadio del protocollo può aiutare a migliorare l'efficienza di differenziazione coerente tra i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Soluzione di risciacquo antiaderente | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning palloni monouso | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment Piastre a 6 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Agitatori a bassa velocità Corning | Fisher Scientific | 11-495-03 | Agitatore magnetico multipiastra per coltura di palloni Spinner |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquotare e congelare |
| DMEM, basso contenuto di glucosio, piruvato, senza glutammina, senza rosso fenolo | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, senza calcio, senza magnesio | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Uova / Barre di agitazione ovali | 2mag | PI20106 | |
| Excelta Pinzette per uso generale | Fisher Scientific | 17-456-103 | Conservare sterile nella cappa per colture cellulari |
| Flacone per terreni monouso EZBio, 250 ml | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Utilizzato per produrre PVA 10% |
| Piastre per colture tissutali standard Falcon (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Pipetta Aspirante Sterile 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Sollevatori di cellule - Sollevatore di cellule | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Rotatori 3D multifunzione Fisher | Scientific | 88-861-047 | Agitatore orbitale |
| Geltrex senza LDEV Fattore di crescita ridotto Matrice a membrana basale | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquotare con ghiaccio e congelare. Un'altra alternativa adatta alla matrice è Matrigel o Cultrex. |
| Reagente delicato per dissociazione cellulare | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Integratore | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutammina. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulina-transferrina-selenio-etanolammina | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Siero sostitutivo - Multi-specie | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquotare e congelare |
| la miscela lipidica 1, chimicamente definita | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sistema di filtrazione sottovuoto sterile 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Sistema di filtrazione sottovuoto sterile Stericup Quick Release-GP 250mL | Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP | Unità di controllo 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Azionamento per agitazione per micropiastre | 2mag | VMF 40600< | strong>6MSP |
| MP Biomedicals Soluzione detergente 7X | Scientific | MP0976670A4 | Detergente adatto alla coltura tissutale. Preparare una soluzione al 5% in acqua |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF e mTeSR Plus medium sono stati testati e sono alternative adatte. |
| Nunc 50 mL Provette da centrifuga coniche sterili | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Provette da centrifuga sterili coniche | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquotare e congelare |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot e congelare |
| pluriStrainer® 200 µ m | Fisher Scientific | NC0776417 | Filtro cellulare |
| pluriStrainer® 500 µ m | Fisher Scientific | NC0822591 | Filtro cellulare |
| Poli(alcol vinilico) 87-90% idrolizzato (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS agitando a 98 gradi C fino a quando non si dissolve, fare in 138-3211-FLS |
| ROCK inibitore Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Pipette sierologiche monouso sterili - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette sierologiche monouso sterili - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Pipetta sierologica sterile monouso - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Terreno a base proteica a basso contenuto proteico senza siero per E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | Se si utilizza più di un MIXdrive |
Riferimenti
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....
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Ristampe e permessi
