Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas
Summary
Aquí describimos un protocolo para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo genera organoides renales en dos semanas. Los organoides renales resultantes se pueden cultivar en matraces giratorios a gran escala o placas de agitación magnética de múltiples pozos para enfoques paralelos de prueba de drogas.
Abstract
Los organoides renales generados a partir de hPSC han proporcionado una fuente ilimitada de tejido renal. Los organoides renales humanos son una herramienta invaluable para estudiar la enfermedad y las lesiones renales, desarrollar terapias basadas en células y probar nuevas terapias. Para tales aplicaciones, se necesita un gran número de organoides uniformes y ensayos altamente reproducibles. Nos hemos basado en nuestro protocolo de organoides renales publicado anteriormente para mejorar la salud general de los organoides. Este protocolo 3D simple y robusto implica la formación de cuerpos embrionarios uniformes en un medio de componente mínimo que contiene lípidos, suplemento de insulina-transferrina-selenio-etanolamina y alcohol polivinílico con inhibidor de GSK3 (CHIR99021) durante 3 días, seguido de cultivo en medio que contiene reemplazo sérico knock-out (KOSR). Además, los ensayos de agitación permiten reducir la aglomeración de los cuerpos embrionarios y mantener un tamaño uniforme, lo cual es importante para reducir la variabilidad entre los organoides. En general, el protocolo proporciona un método rápido, eficiente y rentable para generar grandes cantidades de organoides renales.
Introduction
En los últimos años, se han desarrollado una serie de protocolos para diferenciar las células madre pluripotentes humanas en organoides renales 1,2,3,4,5. Los organoides renales han proporcionado una herramienta importante para ayudar a la investigación en nuevos enfoques de medicina regenerativa, modelar enfermedades relacionadas con los riñones, realizar estudios de toxicidad y desarrollo de fármacos terapéuticos. A pesar de su amplia aplicabilidad, los organoides renales tienen limitaciones como la falta de maduración, la capacidad limitada de cultivo a largo plazo in vitro y la escasez de varios tipos de células que se encuentran en el riñón humano 6,7,8. Trabajos recientes se han centrado en mejorar el nivel de maduración organoide, alargar los periodos de cultivo y ampliar la complejidad de las poblaciones de células renalesmodificando los protocolos existentes 9,10,11,12. En esta iteración actual de nuestro protocolo establecido 5,13, hemos modificado los componentes del medio en la primera etapa del protocolo a un medio base libre de suero suplementado con insulina-transferrina-selenio-etanolamina (ITSE), lípidos, alcohol polivinílico (E5-ILP) y CHIR99021 (Figura 1). Estos cambios proporcionan un medio totalmente definido, libre de suero, bajo en proteínas, con menos componentes que nuestra composición media anterior 5,13 y sin factores de crecimiento adicionales. Como resultado, el medio de la primera etapa requiere menos mano de obra para preparar que nuestra versión publicada anteriormente, y puede reducir la variabilidad de lote a lote5. Estudios previos han demostrado que tanto la insulina como la transferrina son importantes en el cultivo sin suero14,15, sin embargo, los altos niveles de insulina pueden ser inhibitorios a la diferenciación del mesodermo16. Hemos mantenido los niveles bajos de insulina según lo dispuesto en el protocolo original, y hemos reducido aún más los niveles de KOSR (que contiene insulina) en la segunda etapa del ensayo. En línea con otros protocolos para la formación de organoides renales, los niveles más bajos de KOSR son beneficiosos para mantener un equilibrio entre la proliferación y la diferenciación del tejido renal17. Además, hemos bajado la concentración de glucosa en nuestro medio Estadio II13.
Nuestro método describe una configuración para el ensayo de suspensión de organoides renales, produciendo hasta ~ 1,000 organoides de una placa de cultivo inicial de ~ 60% confluente hPSC 100 mm como se describe en la publicación original 5,13. Este protocolo se puede escalar fácilmente hasta comenzar con múltiples placas de 100 mm o 150 mm para aumentar aún más el número de organoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudios previos han demostrado que los pasos iniciales del protocolo son críticos para la diferenciación del mesodermo intermedio 5,19,20 y, por lo tanto, es esencial implementar una composición media estricta en esta etapa. La eliminación de componentes indefinidos como suero, albúmina, híbrido libre de proteínas medio II de la primera etapa del protocolo puede ayudar a mejorar la eficiencia de diferenciación consisten…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud R01 DK069403, UC2 DK126122 y P30-DK079307 y ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
Riferimenti
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