原位 使用透射电子显微镜探索小鼠巨核细胞生成
Summary
在这里，我们提出了一种使用透射电子显微镜（TEM） 原位 分析巨核细胞超微结构的方案。收集，固定，嵌入环氧树脂中并切割成超薄切片的小鼠骨髓。造影剂染色后，在120 kV的TEM显微镜下观察骨髓。
Abstract
巨核细胞的分化和成熟与骨髓的细胞和细胞外成分密切相关。这些过程的特点是巨核细胞质中必需结构的逐渐出现，例如多倍体和多叶细胞核，称为分界膜系统（DMS）的内部膜网络以及循环血小板中将发现的致密和α颗粒。在本文中，我们描述了使用透射电子显微镜（TEM）对小鼠巨核细胞进行 原位 超微结构研究的标准化方案，从而可以识别定义其成熟阶段和骨髓中细胞密度的关键特征。骨髓被冲洗，固定，在乙醇中脱水，嵌入塑料树脂中，并安装以产生横截面。分别制备用于组织学和TEM观察的半薄片和薄切片。该方法可用于任何EM设施中的任何骨髓细胞，并且具有使用小样本量的优点，允许在同一小鼠上组合多种成像方法。
Introduction
巨核细胞是专门的大多倍体细胞，定位于骨髓中，负责血小板的产生1。它们起源于造血干细胞，通过复杂的成熟过程，在此期间，巨核细胞前体逐渐增加大小，同时在细胞质和细胞核2中经历广泛的伴随形态学变化。在成熟过程中，巨核细胞形成许多可区分的结构元素，包括：多叶细胞核，形成分界膜系统（DMS）的表面膜的内陷，没有细胞器的外围区域被基于肌动蛋白的细胞骨架网络包围，以及许多细胞器，包括α颗粒，致密颗粒，溶酶体和多个高尔基复合物。在超微结构水平上，观察到的主要修饰是细胞质区室化为由DMS3分隔的离散区域。这种广泛的膜供应将推动在血小板生产的初始阶段延长长细胞质过程，然后将在循环中重塑为血小板。巨核细胞分化和成熟过程中的任何缺陷都会在血小板计数和/或血小板功能方面影响血小板的产生。
几十年来，薄层透射电子显微镜（TEM）一直是首选的成像方法，可提供高质量的巨核细胞超微结构，这些超微结构塑造了我们对血栓形成生理学的理解4，5。本文重点介绍了一种标准化的TEM方法，该方法允许捕获天然骨髓微环境中原位发生的血小板生物发生过程，这也可以作为分析任何骨髓细胞类型的基础。我们提供巨核细胞从未成熟到完全成熟的发育的超微结构示例，这些超微结构示例将细胞质过程扩展到正弦6的微循环中。我们还描述了一种量化不同巨核细胞成熟阶段的简单程序，指导骨髓的再生和血小板生产能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
直接检查巨核细胞在其原生环境中对于了解巨核细胞和血小板形成至关重要。在本文中，我们提供了一种透射电子显微镜方法，将骨髓冲洗和浸入固定相结合，允许 原位 解剖骨髓中巨核细胞形态发生整个过程的形态特征。
骨髓冲洗是这种方法的关键步骤，因为高质量冲洗的成功取决于操作员的实践和培训。虽然细腻，但冲洗骨髓是避免去除矿化骨的最佳方法，这通常…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Fabienne Proamer，Jean-Yves Rinckel，David Hoffmann，Monique Freund的技术援助。这项工作得到了ARMESA（医学和公共发展协会）、欧洲联盟通过欧洲区域发展基金（ERDF）和赠款ANR-17-CE14-0001-01向H.d.S.的支持。
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
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