In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission
Summary
Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.
Abstract
La différenciation et la maturation des mégacaryocytes se produisent en étroite association avec les composants cellulaires et extracellulaires de la moelle osseuse. Ces processus sont caractérisés par l’apparition progressive de structures essentielles dans le cytoplasme mégacaryocytaire telles qu’un noyau polyploïde et polylobulé, un réseau membranaire interne appelé système membranaire de démarcation (DMS) et les granules denses et alpha que l’on trouvera dans les plaquettes circulantes. Dans cet article, nous décrivons un protocole standardisé pour l’étude ultrastructurale in situ des mégacaryocytes murins à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM), permettant l’identification de caractéristiques clés définissant leur stade de maturation et leur densité cellulaire dans la moelle osseuse. Les moelles osseuses sont rincées, fixées, déshydratées dans de l’éthanol, incorporées dans de la résine plastique et montées pour générer des sections transversales. Des sections semi-minces et minces sont préparées pour les observations histologiques et TEM, respectivement. Cette méthode peut être utilisée pour n’importe quelle cellule de moelle osseuse, dans n’importe quelle installation EM et présente l’avantage d’utiliser de petites tailles d’échantillons permettant la combinaison de plusieurs approches d’imagerie sur la même souris.
Introduction
Les mégacaryocytes sont de grandes cellules polyploïdes spécialisées, localisées dans la moelle osseuse, responsables de la production deplaquettes 1. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par un processus de maturation complexe, au cours duquel les précurseurs de mégacaryocytes augmentent progressivement en taille, tout en subissant d’importants changements morphologiques concomitants dans le cytoplasme et le noyau2. Au cours de la maturation, les mégacaryocytes développent un certain nombre d’éléments structurels distincts, notamment: un noyau polylobulé, des invaginations de la membrane de surface qui forment le système membranaire de démarcation (DMS), une zone périphérique dépourvue d’organites entourés par le réseau cytosquelette à base d’actine et de nombreux organites, notamment des granules de α, des granules denses, des lysosomes et de multiples complexes de Golgi. Au niveau ultrastructural, une modification majeure observée est la compartimentation cytoplasmique en régions discrètes délimitées par le DMS3. Cet approvisionnement important en membranes alimentera l’extension de longs processus cytoplasmiques dans la phase initiale de la production de plaquettes, qui se remodèleront ensuite en plaquettes à l’intérieur de la circulation. Tout défaut lors de la différenciation et de la maturation des mégacaryocytes peut affecter la production de plaquettes en termes de numération plaquettaire et / ou de fonction plaquettaire.
La microscopie électronique à transmission à couche mince (TEM) est l’approche d’imagerie de choix depuis des décennies, fournissant une ultrastructure de haute qualité de mégacaryocytes qui ont façonné notre compréhension de la physiologie de la thrombopoïèse4,5. Cet article se concentre sur une méthode TEM standardisée permettant de capturer le processus de biogenèse plaquettaire se produisant in situ dans le microenvironnement natif de la moelle osseuse, qui pourrait également servir de base pour analyser tout type de cellule de moelle osseuse. Nous fournissons des exemples ultrastructuraux du développement de mégacaryocytes de immatures à complètement matures, qui étendent les processus cytoplasmiques dans la microcirculation des sinusoïdes6. Nous décrivons également une procédure facile pour quantifier les différentes étapes de maturation des mégacaryocytes, en donnant des instructions sur la régénération et la capacité de production plaquettaire de la moelle osseuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’examen direct des mégacaryocytes dans leur environnement natif est essentiel pour comprendre la mégacaryopoïèse et la formation de plaquettes. Dans ce manuscrit, nous fournissons une méthode de microscopie électronique à transmission combinant le rinçage de la moelle osseuse et la fixation par immersion, permettant de disséquer in situ les caractéristiques morphologiques de l’ensemble du processus de morphogenèse des mégacaryocytes se déroulant dans la moelle osseuse.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), l’Union Européenne à travers le Fonds Européen de Développement Régional (FEDER) et par la Subvention ANR-17-CE14-0001-01 à H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
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