На месте Исследование мышиного мегакариопоэтиса с помощью просвечивающих электронных микроскопий
Summary
Здесь мы представляем протокол анализа ультраструктуры мегакариоцитов in situ с помощью просвечивающих электронных микроскопий (ТЭМ). Мышиные косточки собирают, фиксируют, встраивают в эпоксидную смолу и разрезают на ультратонкие срезы. После контрастного окрашивания костный мозг наблюдается под микроскопом ТЭМ на 120 кВ.
Abstract
Дифференцировка и созревание мегакариоцитов происходят в тесной связи с клеточными и внеклеточными компонентами костного мозга. Эти процессы характеризуются постепенным появлением в цитоплазме мегакариоцитов существенных структур, таких как полиплоидное и полигобулированное ядро, внутренняя мембранная сеть, называемая демаркационной мембранной системой (DMS), и плотные и альфа-гранулы, которые будут найдены в циркулирующих тромбоцитах. В этой статье мы описываем стандартизированный протокол ультраструктурного исследования in situ мышиных мегакариоцитов с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), позволяющий идентифицировать ключевые характеристики, определяющие стадию их созревания и клеточную плотность в костном мозге. Костный мозг промывывается, фиксируется, обезвоживается в этаноле, внедряется в пластиковую смолу и монтируется для создания поперечных сечений. Полутонкие и тонкие срезы подготовлены для гистологических и ТЕА наблюдений соответственно. Этот метод может быть использован для любой клетки костного мозга, в любом электромагнитном объекте и имеет преимущество использования небольших размеров выборки, позволяющих комбинировать несколько подходов к визуализации на одной мыши.
Introduction
Мегакариоциты представляют собой специализированные крупные полиплоидные клетки, локализованные в костном мозге, отвечающие за выработку тромбоцитов1. Они происходят из гемопоэтических стволовых клеток посредством сложного процесса созревания, в ходе которого предшественники мегакариоцитов постепенно увеличиваются в размерах, подвергаясь обширным сопутствующим морфологическим изменениям в цитоплазме и ядре2. Во время созревания мегакариоциты развивают ряд различимых структурных элементов, в том числе: полигобулированное ядро, инвагинации поверхностной мембраны, которые образуют демаркационную мембранную систему (DMS), периферическую зону, лишенную органелл, окруженных цитоскелетной сетью на основе актина, и многочисленные органеллы, включая α-гранулы, плотные гранулы, лизосомы и множественные комплексы Гольджи. На ультраструктурном уровне основной наблюдаемой модификацией является цитоплазматическое разделение на дискретные области, разграниченные DMS3. Этот обширный запас мембран будет способствовать расширению длительных цитоплазматических процессов на начальной фазе производства тромбоцитов, которые затем будут ремоконструированы в тромбоциты внутри циркуляции. Любой дефект во время дифференцировки и созревания мегакариоцитов может влиять на выработку тромбоцитов с точки зрения количества тромбоцитов и/или функции тромбоцитов.
Тонкослойная просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) была подходом к визуализации на протяжении десятилетий, обеспечивая высококачественную ультраструктуру мегакариоцитов, которые сформировали наше понимание физиологии тромбопоизиса4,5. В данной статье основное внимание уделяется стандартизированной методике ТЭМ, позволяющей охватить процесс биогенеза тромбоцитов, происходящий in situ в микросреде нативного костного мозга, который также может служить основой для анализа любого типа клеток костного мозга. Приведены ультраструктурные примеры развития мегакариоцитов от незрелых до полностью зрелых, которые расширяют цитоплазматические процессы в микроциркуляцию синусоид6. Мы также описываем простую процедуру количественной оценки различных стадий созревания мегакариоцитов, инструктируя о регенерации и производительности тромбоцитов костного мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Непосредственное исследование мегакариоцитов в их родной среде имеет важное значение для понимания мегакариопоэтиса и образования тромбоцитов. В данной рукописи представлен метод просвечивающей электронной микроскопии, сочетающий промывку костного мозга и фиксацию погружением, по…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Фабьен Проамер, Жан-Ива Ринкеля, Давида Хоффмана, Моник Фройнд за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте), Европейским союзом через Европейский фонд регионального развития (ERDF) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
