في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل البنية الفوقية للخلايا العملاقة في الموقع باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). يتم جمع نخاع عظم مورين، ثابتة، جزءا لا يتجزأ من راتنج الايبوكسي وقطع في أقسام ultrathin. بعد تلطيخ التباين ، لوحظ نخاع العظم تحت مجهر TEM عند 120 كيلو فولت.
Abstract
يحدث التمايز ونضوج الخلايا الضخمة في ارتباط وثيق مع المكونات الخلوية وخارج الخلية لنخاع العظام. وتتميز هذه العمليات بالمظهر التدريجي للهياكل الأساسية في السيتوبلازم megakaryocyte مثل نواة متعددة الأضلاع وتعدد الأضلاع، وشبكة غشاء داخلي تسمى نظام غشاء الترسيم (DMS) وحبيبات كثيفة وألفا التي سيتم العثور عليها في الصفائح الدموية المتداولة. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول موحد للدراسة فوق الهيكلية في الموقع لخلايا مورين الضخمة باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، مما يسمح بتحديد الخصائص الرئيسية التي تحدد مرحلة نضجها وكثافتها الخلوية في نخاع العظام. يتم مسح نخاع العظم، ثابتة، المجففة في الإيثانول، جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيك، وشنت لتوليد المقاطع العرضية. يتم إعداد أقسام شبه رقيقة ورقيقة لملاحظات الهسهولوجية وTEM، على التوالي. يمكن استخدام هذه الطريقة لأي خلية نخاع العظم، في أي مرفق EM ولها ميزة استخدام أحجام عينة صغيرة مما يسمح لمزيج من عدة نهج التصوير على نفس الماوس.
Introduction
Megakaryocytes هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة متخصصة ، مترجمة في نخاع العظام ، مسؤولة عن إنتاج الصفائح الدموية1. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال عملية نضوج معقدة، خلالها السلائف megakaryocyte زيادة تدريجيا في الحجم، في حين تمر تغييرات مورفولوجية المصاحبة واسعة النطاق في السيتوبلازم والنواة2. أثناء النضج ، تطور الخلايا الضخمة عددا من العناصر الهيكلية المميزة بما في ذلك: نواة متعددة الأضلاع ، وثقب الغشاء السطحي الذي يشكل نظام غشاء الترسيم (DMS) ، ومنطقة محيطية خالية من العضيات محاطة بالشبكة الخلوية القائمة على actin ، والعديد من العضيات بما في ذلك حبيبات α ، والحبيبات الكثيفة ، والليسوسومات ، والعديد من مجمعات غولجي. على مستوى البنية الفائقة ، لوحظ تعديل كبير هو تقسيم السيتوبلازمية إلى مناطق منفصلة محددة بواسطة DMS3. هذا العرض الواسع من الأغشية سوف يغذي تمديد العمليات السيتوبلازمية الطويلة في المرحلة الأولية من إنتاج الصفائح الدموية ، والتي إعادة تشكيلها بعد ذلك إلى الصفائح الدموية داخل الدورة الدموية. أي عيب أثناء التمايز megakaryocyte والنضج يمكن أن تؤثر على إنتاج الصفائح الدموية من حيث عدد الصفائح الدموية و / أو وظيفة الصفائح الدموية.
طبقة رقيقة انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم نهج التصوير المفضل لعقود توفير ultrastructure عالية الجودة من megakaryocytes التي شكلت فهمنا لعلم وظائف الأعضاء من خثار4،5. تركز هذه الورقة على طريقة TEM موحدة تسمح بالتقاط عملية التكوين الحيوي للصفائح الدموية التي تحدث في الموقع داخل البيئة الدقيقة لنخاع العظم الأصلي ، والتي يمكن أن تكون أيضا بمثابة أساس لتحليل أي نوع من خلايا نخاع العظم. نحن نقدم أمثلة فائقة البنية لتطوير الخلايا الضخمة من غير ناضجة إلى ناضجة تماما ، والتي تمتد العمليات السيتوبلازمية في دوران الأوعية الدقيقة من الجيوبالأنفية 6. كما نقوم بوصف إجراء سهل لقياس مراحل نضوج الخلايا الضخمة المختلفة، مع إرشادك إلى قدرة إنتاج التجدد والصفائح الدموية لنخاع العظم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفحص المباشر للخلايا الضخمة في بيئتها الأصلية أمر ضروري لفهم الخلايا الضخمة وتشكيل الصفائح الدموية. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة المجهر الإلكتروني انتقال الجمع بين مسح نخاع العظم والتثبيت عن طريق الغمر، مما يسمح لتشريح في الموقع خصائص مورفولوجيا العملية برمتها من مورفوجينيسيس megakar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا فابيان بروامر وجان إيف رينكل وديفيد هوفمان ومونيك فرويند على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة الأوروبية للتنمية الإقليمية والاتحاد الأوروبي من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ومنظمة المنحة ANR-17-CE14-0001-01 إلى H.D.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
