In Situ Udforskning af Murine Megakaryopoiesis ved hjælp af Transmission ElektronMikroskopi
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at analysere ultrastruktur af megakaryocytterne in situ ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). Murin knoglemarv indsamles, fast, indlejret i epoxyharpiks og skæres i ultratynde sektioner. Efter kontrastfarvning observeres knoglemarven under et TEM-mikroskop ved 120 kV.
Abstract
Differentiering og modning af megakaryocytter forekommer i tæt samarbejde med de cellulære og ekstracellulære komponenter i knoglemarven. Disse processer er karakteriseret ved den gradvise forekomst af væsentlige strukturer i megakaryocytcytcytoplasmaet som en polyploid og polylobuleret kerne, et internt membrannetværk kaldet afgrænsning membransystem (DMS) og de tætte og alfagranulat, der vil blive fundet i cirkulerende blodplader. I denne artikel beskriver vi en standardiseret protokol for in situ ultrastrukturelle undersøgelse af murine megakaryocytter ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), der giver mulighed for identifikation af nøglekarakteristika, der definerer deres modningsstadium og cellulær tæthed i knoglemarven. Knoglemarv er skyllet, fast, dehydreret i ethanol, indlejret i plastharpiks, og monteret til generering af tværsnit. Halvtynde og tynde sektioner er forberedt til henholdsvis histologiske og TEM-observationer. Denne metode kan bruges til enhver knoglemarvscelle, i enhver EM-facilitet og har den fordel at bruge små prøvestørrelser, der giver mulighed for kombinationen af flere billeddannelsesmetoder på den samme mus.
Introduction
Megakaryocytter er specialiserede store polyploidceller, lokaliseret i knoglemarven, der er ansvarlig for blodpladeproduktion1. De stammer fra hæmatoopoietiske stamceller gennem en indviklet modningsproces, hvor megakaryocytprækursorer gradvist øges i størrelse, mens de gennemgår omfattende samtidige morfologiske ændringer i cytoplasmaet og kernen2. Under modning udvikler megakaryocytter en række forskellige strukturelle elementer, herunder: en polylobuleret kerne, invaginationer af overflademembranen, der danner afgrænsningsmembransystemet (DMS), en perifer zone uden organeller omgivet af det actinbaserede cytoskeletale netværk og talrige organeller, herunder α granulater, tætte granulater, lysosomer og flere Golgi-komplekser. På det ultrastrukturelle niveau observeres en væsentlig ændring den cytoplasmatiske opdeling i diskrete regioner afgrænset af DMS3. Denne omfattende forsyning af membraner vil brændstof forlængelsen af lange cytoplasmaiske processer i den indledende fase af blodpladeproduktion, som derefter vil ombygges til blodplader inde i cirkulationen. Enhver defekt under megakaryocytdifferentiering og modning kan påvirke blodpladeproduktionen i form af blodpladeantal og/eller blodpladefunktion.
Tyndt lag transmission elektronmikroskopi (TEM) har været billeddannelse tilgang valg i årtier giver høj kvalitet ultrastruktur af megakaryocytter, der har formet vores forståelse af fysiologi af trombopoiesis4,5. Dette papir fokuserer på en standardiseret TEM metode gør det muligt at fange processen med blodplade biogenese forekommer in situ inden for den indfødte knoglemarvs mikromiljø, som også kunne tjene som grundlag for at analysere enhver knoglemarvscelletype. Vi giver ultrastrukturelle eksempler på udviklingen af megakaryocytter fra umodne til fuldt modne, som udvider cytoplasmaiske processer i mikrocirkulationen af sinusoider6. Vi beskriver også en nem procedure for at kvantificere de forskellige megakaryocyt modning faser, instruere om regenerering og blodplade produktionskapacitet af knoglemarven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Direkte undersøgelse af megakaryocytter i deres oprindelige miljø er afgørende for at forstå megakaryopoiesis og blodplade dannelse. I dette manuskript leverer vi en transmissionselektronmikroskopimetode, der kombinerer knoglemarvsskylning og fiksering ved nedsænkning, hvilket gør det muligt at dissekere in situ morfologiegenskaberne for hele processen med megakaryocytmorphogenese, der finder sted i knoglemarven.
Skylningen af knoglemarven er et kritisk trin i denne metode, da s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Den Europæiske Union gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) og af Grant ANR-17-CE14-0001-01 til H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
