Summary

सीटू में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मुरीन मेगाकारियोपोइसिस की खोज

Published: September 08, 2021
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Summary

यहां, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके सीटू में मेगाकारियोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मुरीन बोन मैरो एकत्र किए जाते हैं, तय किए जाते हैं, एपॉक्सी राल में एम्बेडेड होते हैं और अल्ट्राथिन वर्गों में कटौती करते हैं। इसके विपरीत धुंधला होने के बाद, बोन मैरो को 120 केवी पर टेम माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है।

Abstract

मेगाकारियोसाइट्स का भेदभाव और परिपक्वता बोन मैरो के सेलुलर और बाह्यकोशिक घटकों के साथ निकट सहयोग में होती है। इन प्रक्रियाओं को मेगाकारियोसाइट साइटोप्लाज्म में आवश्यक संरचनाओं की क्रमिक उपस्थिति जैसे पॉलीप्लाइड और पॉलीलोबुलेटेड न्यूक्लियस, एक आंतरिक झिल्ली नेटवर्क जैसे सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) और घने और अल्फा कणिकाओं की विशेषता है जो प्लेटलेट्स परिसंचारी में पाए जाएंगे। इस लेख में, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके मुरीन मेगाकारियोसाइट्स के सीटू अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन में एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बोन मैरो में उनके परिपक्वता चरण और सेलुलर घनत्व को परिभाषित करने वाली प्रमुख विशेषताओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। बोन मैरो को फ्लश किया जाता है, तय किया जाता है, इथेनॉल में निर्जलित किया जाता है, प्लास्टिक राल में एम्बेडेड होता है, और क्रॉस-सेक्शन पैदा करने के लिए घुड़सवार होता है। अर्ध-पतली और पतले वर्ग क्रमशः हिस्टोलॉजिकल और तेम टिप्पणियों के लिए तैयार किए जाते हैं। इस विधि का उपयोग किसी भी बोन मैरो सेल के लिए किया जा सकता है, किसी भी ईएम सुविधा में और एक ही माउस पर कई इमेजिंग दृष्टिकोणों के संयोजन के लिए अनुमति देने वाले छोटे नमूना आकारों का उपयोग करने का लाभ है।

Introduction

मेगाकारियोसाइट्स विशेष बड़े पॉलीप्लाइड कोशिकाएं हैं, जो बोन मैरो में स्थानीयकृत हैं, जो प्लेटलेट उत्पादन1के लिए जिम्मेदार हैं। वे एक जटिल परिपक्वता प्रक्रिया के माध्यम से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जिसके दौरान मेगाकारियोसाइट अग्रदूत उत्तरोत्तर आकार में वृद्धि करते हैं, जबकि साइटोप्लाज्म और नाभिक 2 में व्यापक सहवर्ती रूपात्मक रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरतेहैं। परिपक्वता के दौरान, मेगाकारियोसाइट्स कई विशिष्ट संरचनात्मक तत्वों का विकास करते हैं जिनमें शामिल हैं: एक पॉलीलोब्लुलेटेड न्यूक्लियस, सतह झिल्ली के इन्वेजिनेशन जो सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) बनाते हैं, एक परिधीय क्षेत्र जो ऐक्टिन आधारित साइटोस्केलेटल नेटवर्क से घिरे ऑर्गेनेल्स से रहित है, और α-कणिकाओं, घने कणिकाओं, lysosomes, और कई गोलगी परिसरों सहित कई ऑर्गेनेल्स। अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर, एक प्रमुख संशोधन देखा गया है कि डीएमएस3द्वारा सीमित असतत क्षेत्रों में साइटोप्लाज्मिक कंपार्टमेंटाइजेशन है। झिल्ली की यह व्यापक आपूर्ति प्लेटलेट उत्पादन के प्रारंभिक चरण में लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के विस्तार को बढ़ावा देगी, जो तब परिसंचरण के अंदर प्लेटलेट्स में फिर से तैयार हो जाएगी। मेगाकार्योसाइट भेदभाव और परिपक्वता के दौरान कोई भी दोष प्लेटलेट काउंट और/या प्लेटलेट फंक्शन की अवधि में प्लेटलेट उत्पादन को प्रभावित कर सकता है ।

पतली परत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) दशकों से पसंद का इमेजिंग दृष्टिकोण रहा है जो मेगाकारियोसाइट्स की उच्च गुणवत्ता वाले अल्ट्रास्ट्रक्चर प्रदान करता है जिसने थ्रोम्बोपोइसिस4,5के शरीर विज्ञान की हमारी समझ को आकार दिया है। यह पेपर एक मानकीकृत टेम विधि पर केंद्रित है जो देशी अस्थि मज्जा माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर सीटू में होने वाली प्लेटलेट बायोजेनेसिस की प्रक्रिया को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो किसी भी अस्थि मज्जा कोशिका प्रकार का विश्लेषण करने के लिए एक आधार के रूप में भी काम कर सकता है। हम अपरिपक्व से पूरी तरह परिपक्व तक मेगाकारियोसाइट्स के विकास के अल्ट्रास्ट्रक्चरल उदाहरण प्रदान करते हैं, जो साइनसॉइड6के माइक्रोसर्कुलेशन में साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। हम बोन मैरो के पुनर्जनन और प्लेटलेट उत्पादन क्षमता पर निर्देश देते हुए विभिन्न मेगाकार्योसाइट परिपक्वता चरणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया 2010/63/यूरोपीय संघ और स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर CREMEAS समिति (Comité Régional d’ Ethique en Matière d ‘ Expérimentation Animale स्ट्रासबर्ग) । प्रोटोकॉल क?…

Representative Results

बोन मैरो हिस्ट्रोलॉजीएक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत बोन मैरो टोल्यूडीन ब्लू हिस्टोलॉजी का अवलोकन जैसे, ऊतक कॉम्पैक्टनेस, माइक्रोवेसेल निरंतरता, और मेगाकारियोसाइट्स (चित्रा 1D)</stro…

Discussion

मेगाकारियोपोइसिस और प्लेटलेट बनने को समझने के लिए उनके मूल वातावरण में मेगाकारियोसाइट्स की सीधी जांच जरूरी है। इस पांडुलिपि में, हम विसर्जन द्वारा बोन मैरो फ्लशिंग और निर्धारण के संयोजन के लिए एक ट्?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक तकनीकी सहायता के लिए फैबियन प्रोमर, जीन-येव्स रेन्केल, डेविड हॉफमैन, मोनिक फ्रायंड का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक), यूरोपीय संघ द्वारा यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) के माध्यम से और ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 द्वारा H.D.S. को समर्थन दिया गया था ।

Materials

2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) Ladd Research Industries, USA 21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar Electron Microscopy Sciences, USA 1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate Merck, Germany 2083
Copper grids 200 mesh thin-bar Oxford Instrument, Agar Scientifics, England T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate Merck, Germany 8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) Ladd Research Industries, USA 21340
Double Edge Stainless Razor blade Electron Microscopy Sciences-EMS, USA EM-72000
Ethanol absolut VWR International, France 20821296
Filter paper, 90 mm diameter Whatman, England 512-0326
Flat embedding silicone mould Oxford Instrument, Agar Scientific, England G3533
Glutaraldehyde 25% Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 16210
Heat plate Leica EMMP Leica Microsystems GmbH, Austria 705402
Histo Diamond Knife 45° Diatome, Switzerland 1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope JEOL, Japan EM-21001BU
Lead citrate – Ultrostain 2 Leica Microsystems GmbH, Austria 70 55 30 22
LX-112 resin Ladd Research Industries, USA 21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate Sigma, France M2393-100g
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA) Ladd Research Industries, USA 21350
Osmium tetroxide 2% Merck, Germany 19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) Sigma, France 82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl C.D.M Lavoisier, France MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade Swann-Morton, England .0508
Sodium tetraborate – Borax Sigma, France B-9876
Sucrose Merck, Germany 84100-1KG
Syringe filter 0.2µm Pall Corporation, USA 514-4126
Toluidine blue Ladd Research Industries, USA N10-70975
Trimmer EM TRIM2 Leica Microsystems GmbH, Austria 702801
Ultramicrotome Ultracut UCT Leica Microsystems GmbH, Austria 656201
Uranyl acetate Ladd Research Industries, USA 23620

Riferimenti

  1. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  2. Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
  3. Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
  4. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
  5. Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
  6. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
  7. Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
  8. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
  9. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  10. Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
  11. Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
  12. Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
  13. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  14. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
check_url/it/62494?article_type=t

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Citazione di questo articolo
Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e62494, doi:10.3791/62494 (2021).

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