In situ Utforskning av Murine Megakaryopoiesis ved hjelp av Transmission Electron Microscopy
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere ultrastruktur av megakaryocyttene in situ ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Murine benmarger samles, festes, legges inn i epoksyharpiks og kuttes i ultratynne seksjoner. Etter kontrastfarging observeres benmargen under et TEM-mikroskop ved 120 kV.
Abstract
Differensiering og modning av megakaryocytter forekommer i nær tilknytning til de cellulære og ekstracellulære komponentene i benmargen. Disse prosessene er preget av gradvis utseende av essensielle strukturer i megakaryocytt cytoplasma som en polyploid og polylobulert kjerne, et internt membrannettverk kalt avgrensningsmembransystem (DMS) og de tette og alfagranulatene som finnes i sirkulerende blodplater. I denne artikkelen beskriver vi en standardisert protokoll for in situ ultrastrukturell studie av murine megakaryocytter ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), noe som muliggjør identifisering av nøkkelegenskaper som definerer modningsstadiet og cellulær tetthet i benmargen. Benmarger skylles, festes, dehydreres i etanol, innebygd i plastharpiks og monteres for å generere tverrsnitt. Semitynne og tynne seksjoner er forberedt på henholdsvis histologiske og TEM observasjoner. Denne metoden kan brukes til en hvilken som helst benmargcelle, i ethvert EM-anlegg og har fordelen av å bruke små prøvestørrelser som tillater kombinasjonen av flere bildemetoder på samme mus.
Introduction
Megakaryocytter er spesialiserte store polyploide celler, lokalisert i benmargen, ansvarlig for blodplateproduksjon1. De stammer fra hematopoietiske stamceller gjennom en intrikat modningsprosess, hvor megakaryocyttforløpere gradvis øker i størrelse, mens de gjennomgår omfattende samtidige morfologiske endringer i cytoplasma og kjerne2. Under modning utvikler megakaryocytter en rekke skilles strukturelle elementer, inkludert: en polylobulert kjerne, invaginasjoner av overflatemembranen som danner avgrensningsmembransystemet (DMS), en perifer sone blottet for organeller omgitt av aktinbaserte cytoskeletalnettverk og mange organeller, inkludert α granulater, tette granulater, lysosomer og flere Golgi-komplekser. På ultrastrukturelt nivå er en stor modifikasjon observert den cytoplasmatiske oppdelingen i diskrete områder avgrenset av DMS3. Denne omfattende tilførselen av membraner vil gi drivstoff til forlengelsen av lange cytoplasmatiske prosesser i den første fasen av blodplateproduksjonen, som deretter vil omdannes til blodplater inne i sirkulasjonen. Eventuelle feil under megakaryocyttdifferensiering og modning kan påvirke blodplateproduksjonen når det gjelder blodplatetelling og / eller blodplatefunksjon.
Tynn lagoverføring elektronmikroskopi (TEM) har vært den valgte bildemetoden i flere tiår som gir ultrastruktur av megakaryocytter av høy kvalitet som har formet vår forståelse av fysiologien til trombopoiesis4,5. Dette dokumentet fokuserer på en standardisert TEM-metode som gjør det mulig å fange prosessen med blodplatebiogenese som forekommer in situ innenfor det opprinnelige benmargsmikromiljøet, som også kan tjene som grunnlag for å analysere hvilken som helst benmargscelletype. Vi gir ultrastrukturelle eksempler på utvikling av megakaryocytter fra umodne til fullt modne, som utvider cytoplasmatiske prosesser inn i mikrosirkulasjonen av bihuler6. Vi beskriver også en enkel prosedyre for å kvantifisere de forskjellige megakaryocyttmodningsstadiene, instruere på regenererings- og blodplateproduksjonskapasiteten til benmargen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Direkte undersøkelse av megakaryocytter i deres opprinnelige miljø er avgjørende for å forstå megakaryopoiesis og blodplatedannelse. I dette manuskriptet tilbyr vi en transmisjonselektronmikroskopimetode som kombinerer benmargspyling og fiksering ved nedsenking, slik at vi kan dissekere morfologiegenskapene til hele prosessen med megakaryocytt morfogenese som foregår i benmargen.
Rødme av benmargen er et kritisk trinn i denne metoden, da suksessen med en rødme av høy kvalitet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), EU gjennom European Regional Development Fund (ERDF) og av Grant ANR-17-CE14-0001-01 til H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
