Summary

In situ Utforskning av Murine Megakaryopoiesis med transmissionselektronmikroskopi

Published: September 08, 2021
doi:

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera ultrastructure av megakaryocyterna in situ med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM). Murin benmärg samlas in, fixas, bäddas in i epoxiharts och skärs i ultrathin sektioner. Efter kontrastfärgning observeras benmärgen under ett TEM-mikroskop vid 120 kV.

Abstract

Differentiering och mognad av megakaryocyter förekommer i nära samband med cellulära och extracellulära komponenter i benmärgen. Dessa processer kännetecknas av det gradvisa utseendet av väsentliga strukturer i megakaryocytcytplasman såsom en polyploid och polylobulated kärna, ett internt membrannätverk som kallas avgränsning membransystem (DMS) och de täta och alfagranulat som finns i cirkulerande trombocyter. I den här artikeln beskriver vi ett standardiserat protokoll för in situ ultrastructural studie av murine megakaryocyter med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM), vilket möjliggör identifiering av viktiga egenskaper som definierar deras mognadsstadium och cellulära densitet i benmärgen. Benmärgar spolas, fixeras, dehydreras i etanol, bäddas in i plastharts och monteras för att generera tvärsnitt. Halvtunna och tunna sektioner är förberedda för histologiska respektive TEM observationer. Denna metod kan användas för alla benmärgsceller, i alla EM-anläggningar och har fördelen att använda små provstorlekar som möjliggör kombinationen av flera bildframställningsmetoder på samma mus.

Introduction

Megakaryocyter är specialiserade stora polyploida celler, lokaliserade i benmärgen, ansvariga för trombocytproduktion1. De härstammar från hematopoetiska stamceller genom en invecklad mognadsprocess, under vilken megakaryocytprekursorer gradvis ökar i storlek, samtidigt som de genomgår omfattande samtidiga morfologiska förändringar i cytoplasman och kärnan2. Under mognad utvecklar megakaryocyter ett antal urskiljbara strukturella element, inklusive: en polylobulerad kärna, invaginationer av ytmembranet som bildar avgränsning membranet (DMS), en perifer zon utan organeller omgiven av det aktinbaserade cytoskeletala nätverket och många organeller inklusive α-granuler, täta granulat, lysosomer och flera Golgi-komplex. På den strukturella nivån är en större modifiering som observeras den cytoplasmiska compartmentalizationen i diskreta regioner avgränsade av DMS3. Denna omfattande tillförsel av membran kommer att driva förlängningen av långa cytoplasmiska processer i den inledande fasen av trombocytproduktionen, som sedan kommer att omvandlas till trombocyter inuti cirkulationen. Eventuella defekter under megakaryocytdifferentiering och mognad kan påverka trombocytproduktionen när det gäller trombocytantal och/eller trombocytfunktion.

Tunt lager transmission elektronmikroskopi (TEM) har varit den bildframställningsmetod som valts i årtionden vilket ger högkvalitativ ultrastruktur av megakaryocyter som har format vår förståelse av fysiologin hos trombopoiesis4,5. Detta dokument fokuserar på en standardiserad TEM-metod som gör det möjligt att fånga processen av trombocyt biogenes som förekommer in situ inom den inhemska benmärg mikromiljön, som också kan tjäna som grund för att analysera någon benmärg cell typ. Vi ger strukturella exempel på utvecklingen av megakaryocyter från omogna till fullt mogna, vilket förlänger cytoplasmiska processer till mikrocirkulationen av sinusoider6. Vi beskriver också ett enkelt förfarande för att kvantifiera de olika megakaryocyt mogna stadierna, instruera om regenerering och trombocyt produktionskapacitet benmärgen.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska standarder 2010/63/EU och CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments vid universitetet i Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg). Protokollet visas schematiskt i figur 1. 1. Insamling och fixering av benmärg (figur 1A) VARNING: Denna procedur omfattar cancerframkallande, mutagena och/eller gift…

Representative Results

Benmärg histologiObservation av benmärgens toluidinblå histologi under ett ljusmikroskop är nyckeln till att snabbt analysera den övergripande vävnadsarkitekturen när det gäller t.ex. vävnadskomprimitet, mikrovesselkontinuitet och storlek och form av megakaryocyter (figur 1D). Det utförs före ultrathin sektioner för att bestämma behovet av att skära djupare i benmärg blocket. På grund av deras jättestorlek och nukleära lobulation kan de…

Discussion

Direkt undersökning av megakaryocyter i deras ursprungliga miljö är avgörande för att förstå megakaryopoiesis och trombocytbildning. I detta manuskript tillhandahåller vi en överföring elektronmikroskopi metod som kombinerar benmärg spolning och fixering genom nedsänkning, så att dissekera in situ morfologi egenskaper hos hela processen av megakaryocyt morfogenes äger rum i benmärgen.

Spolningen av benmärgen är ett kritiskt steg i denna metod, eftersom framgången fö…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Europeiska unionen genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF) och genom anslag ANR-17-CE14-0001-01 till H.d.S.

Materials

2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) Ladd Research Industries, USA 21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar Electron Microscopy Sciences, USA 1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate Merck, Germany 2083
Copper grids 200 mesh thin-bar Oxford Instrument, Agar Scientifics, England T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate Merck, Germany 8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) Ladd Research Industries, USA 21340
Double Edge Stainless Razor blade Electron Microscopy Sciences-EMS, USA EM-72000
Ethanol absolut VWR International, France 20821296
Filter paper, 90 mm diameter Whatman, England 512-0326
Flat embedding silicone mould Oxford Instrument, Agar Scientific, England G3533
Glutaraldehyde 25% Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 16210
Heat plate Leica EMMP Leica Microsystems GmbH, Austria 705402
Histo Diamond Knife 45° Diatome, Switzerland 1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope JEOL, Japan EM-21001BU
Lead citrate – Ultrostain 2 Leica Microsystems GmbH, Austria 70 55 30 22
LX-112 resin Ladd Research Industries, USA 21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate Sigma, France M2393-100g
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA) Ladd Research Industries, USA 21350
Osmium tetroxide 2% Merck, Germany 19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) Sigma, France 82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl C.D.M Lavoisier, France MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade Swann-Morton, England .0508
Sodium tetraborate – Borax Sigma, France B-9876
Sucrose Merck, Germany 84100-1KG
Syringe filter 0.2µm Pall Corporation, USA 514-4126
Toluidine blue Ladd Research Industries, USA N10-70975
Trimmer EM TRIM2 Leica Microsystems GmbH, Austria 702801
Ultramicrotome Ultracut UCT Leica Microsystems GmbH, Austria 656201
Uranyl acetate Ladd Research Industries, USA 23620

Riferimenti

  1. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  2. Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
  3. Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
  4. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
  5. Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
  6. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
  7. Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
  8. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
  9. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  10. Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
  11. Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
  12. Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
  13. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  14. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
check_url/it/62494?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e62494, doi:10.3791/62494 (2021).

View Video