تلطيخ السيتوبلازمية Ca2+ مع فلوو-4/AM في لب التفاح

Summary

تم تحميل البروتوبلاستات المعزولة لخلايا لب التفاح بكاشف فلوري للكالسيوم للكشف عن تركيز Ca²⁺ السيتوبلازمي.

Abstract

Cytosolic Ca^{2 +} يلعب دورا رئيسيا في تطوير النبات. تصوير الكالسيوم هو الأسلوب الأكثر تنوعا للكشف عن التغيرات الديناميكية في Ca^{2 +} في السيتوبلازم. في هذه الدراسة، حصلنا على بروتوبلاستس قابلة للحياة من خلايا اللب عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. تم احتضان البروتوبلاست المعزول مع كاشف الفلورسنت صغير الجزيء (Fluo-4/AM) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المسابير الفلورية ملطخة بنجاح cytosolic Ca^{2 +} ولكن لم تتراكم في vacuoles. La³⁺، مانع قناة Ca^{2 +} ، انخفض كثافة الفلورية السيتوبلازمية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام Fluo-4/AM للكشف عن التغيرات في السيتوسوليك Ca²⁺ في لحم الفاكهة. باختصار، نقدم طريقة لعزل البروتوبلاست بشكل فعال من خلايا اللحم في الفاكهة والكشف عن Ca²⁺ عن طريق تحميل كاشف فلوري الكالسيوم صغير الجزيء في السيتوبلازم لخلايا اللب.

Introduction

Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل إشارة النبات والتمثيل الغذائي^1،2. علاوة على ذلك ، فإنه ينظم سمات جودة الفاكهة^3،4، بما في ذلك صلابة ، محتوى السكر ، والتعرض للاضطرابات الفسيولوجية أثناء التخزين^5،6. السيتوبلازمية Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل الإشارات وينظم نمو النبات والتنمية⁷. اضطراب التوازن الكالسيوم الخلوي يمكن أن تحفز حفرة مريرة في التفاح⁸، مرض بقعة بنية اللون في الكمثرى⁹، وتعفن السرة في الطماطم¹⁰، مما يؤثر على جودة الفاكهة ويسبب خسائر اقتصادية شديدة^3،11. التصوير بالكالسيوم لديه ما يكفي من الدقة المكانية والزمنية وهو وسيلة هامة^{لمراقبة ديناميات} Ca 2 + في الخلايا الحية^12،13.

في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان رئيسيتان لتصوير الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الحية: واحدة تستخدم مسابير فلورية كيميائية صغيرة جزيئية¹⁴، والأخرى هي مستشعر ترميز الجينات (GECI)^15،16. نظرا لصعوبة إنشاء نظام معدل وراثيا مستقر في أشجار الفاكهة وتطوير الفاكهة لفترة أطول ، فإن GECI_S غير مناسب لتصوير الفاكهة Ca^{2 +} fluorescence.

مسابير الفلورسنت جزيء صغير مثل فلوو-4/AM لها ميزة خاصة: شكلها إستر AM (الخلية نفاذية أستوكسي ميثيل استر مشتق) يمكن بسهولة الجزء الأكبر تحميلها في الخلايا الحية دون الحاجة إلى الترافيكتيون، مما يجعلها مرنة وسريعة وغير سامة للخلايا¹⁷. فلوو-4/AM يمكن تحميلها بنجاح في أنبوب حبوب اللقاح من Pyrus pyrifolia¹⁸ وبيتونيا،¹⁹ وكذلك في خلايا الحراسة²⁰ والشعر الجذر من Arabidopsis²¹.

في الوقت الحاضر، وهناك تقارير قليلة عن تلطيخ مضان الكالسيوم من خلايا اللب²². كعنصر معدني مهم، يلعب الكالسيوم دورا رئيسيا في نمو ومراقبة جودة ثمار الأشجار مثل التفاح. ومن المسلم به عالميا أشجار التفاح كنوع اقتصادي مهم، والتفاح تعتبر الغذاء الصحي²³. في هذه الدراسة، حصلنا على protoplasts قابلة للحياة من لب فاكهة التفاح من خلال التحلل المائي الأنزيمي ومن ثم تحميل الكواشف الفلورية جزيء صغير في السيتوبلازم للكشف عن Ca^{2 +}.

Protocol

1. استخراج بروتوبلاست إعداد الحل الأساسي: 20 م م كل2، 5 م 2 -(N-morpholino) حمض الإيثانسولفونيك، و 0.4 M D-sorbitol.ملاحظة: تم ضبط درجة الحموضة للمحلول الأساسي إلى 5.8 مع 0.1 متر تريس العازلة، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات للذوبان في الماء، وتخزينها في 4 درجة مئوية. إعداد الحل ا…

Representative Results

بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، استخدمنا الأسلوب الأنزيمي للحصول على بروتوبلاست قابلة للحياة من اللب(الشكل 1). وكان بعض protoplasts vacuoles ، في حين أن البعض الآخر لا. في حين أن protoplasts أظهرت أي مضان عندما لم يتم تحميل مؤشر Ca2 + الفلورسنت فيها. عندما تم تحميل Fluo-4/AM في protoplasts ، أصبح ا…

Discussion

في هذه الدراسة ، تم الحصول على protoplasts قابلة للحياة عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب التفاح الطازج. ويسمح هذا البروتوكول بالعزل السريع لعدد كبير من المواد الأولية عن لب الفاكهة لاستخدامها في الدراسات البحثية. ولا يقتصر تطبيق هذه الطريقة على ‘فوجي’؛ بل إن المسألة هي أ…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.