Des protoplastes isolés de cellules de pulpe de pomme ont été chargés d’un réactif fluorescent de calcium pour détecter la concentration cytoplasmique de Ca2+.
Le Ca2+ cytosolique joue un rôle clé dans le développement des plantes. L’imagerie calcique est la méthode la plus polyvalente pour détecter les changements dynamiques dans le Ca2+ dans le cytoplasme. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables de cellules pulpaires par hydrolyse enzymatique. Des protoplastes isolés ont été incubés avec le réactif fluorescent à petites molécules (Fluo-4/AM) pendant 30 min à 37 °C. Les sondes fluorescentes ont réussi à coloré le Ca2+ cytosolique mais ne se sont pas accumulées dans les vacuoles. La3+,un bloqueur de canaux Ca2+, a diminué l’intensité de la fluorescence cytoplasmique. Ces résultats suggèrent que Fluo-4/AM peut être utilisé pour détecter les changements dans le Ca2+ cytosolique dans la chair du fruit. En résumé, nous présentons une méthode pour isoler efficacement les protoplastes des cellules de chair du fruit et détecter le Ca2+ en chargeant un réactif fluorescent de calcium à petites molécules dans le cytoplasme des cellules pulpaires.
Ca2+ joue un rôle important dans la transduction du signal végétal et le métabolisme1,2. En outre, il régule les caractéristiques de qualité des fruits3,4, y compris la dureté, la teneur en sucre et la susceptibilité aux troubles physiologiques pendant le stockage5,6. Le Ca2+ cytoplasmique joue un rôle important dans la transduction du signal et régule la croissance et le développement des plantes7. La perturbation de l’homéostasie cellulaire du calcium peut induire une fosse amère dans les pommes8, la maladie des taches brunes dans les poires9et la pourriture ombilicale dans les tomates10, affectant la qualité des fruits et causant de graves pertes économiques3,11. L’imagerie calcique a une résolution spatiale et temporelle suffisante et est une méthode importante pour observer la dynamique du Ca2+ dans les cellules vivantes12,13.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes principales pour l’imagerie calcique intracellulaire dans les cellules vivantes: l’une utilise des sondes fluorescentes chimiques à petites molécules14, et l’autre est le capteur de codage génique (GECI)15,16. Compte tenu de la difficulté d’établir un système transgénique stable dans les arbres fruitiers et du développement plus long des fruits, GECIS ne convient pas à l’imagerie par fluorescence ca2+ des fruits.
Les sondes fluorescentes à petites molécules telles que Fluo-4/AM présentent un avantage particulier : leur forme d’ester AM (dérivé d’ester acétoxyméthyléfiable aux cellules) peut être facilement chargée en vrac dans des cellules vivantes sans avoir besoin de transfection, ce qui la rend flexible, rapide et non cytotoxique17. Fluo-4 / AM pourrait être chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia18 et Petunia,19 ainsi que dans les cellules de garde20 et les poils racinaires d’Arabidopsis 21.
À l’heure actuelle, il existe peu de rapports sur la coloration par fluorescence de calcium des cellules de la pulpe22. En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que les pommes. Les pommiers sont mondialement reconnus comme une espèce économique importante, et les pommes sont considérées comme un aliment sain23. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables à partir de pulpe de fruit de pomme par hydrolyse enzymatique, puis chargé des réactifs fluorescents à petites molécules dans le cytoplasme pour détecter ca2+.
Dans cette étude, des protoplastes viables ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Notez que cette méthode nécessite des pommes fraîches. Le présent protocole permet l’isolement rapide d’un grand nombre de protoplastes de la pulpe de fruit pour une utilisation dans des études de recherche. L’applicabilité de cette méthode ne se limite pas à « Fuji »; les protoplastes de la pulpe de pomme de ‘Dounan’ et ‘Honey Crisp’ peuvent également être extraits par le même protocole(Figure supplémen…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le projet d’amélioration des variétés agricoles de la province du Shandong (2019LZGC007) et l’équipe d’innovation des arbres fruitiers du système technologique moderne de l’industrie agricole du Shandong (SDAIT-06-05).
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |