פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca2 + .
Cytosolic Ca2 + ממלא תפקיד מפתח בפיתוח הצמח. הדמיית סידן היא השיטה המגוונת ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ב- Ca2+ בציטופלסמה. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא של תאי עיסת על ידי הידרוליזה אנזימטית. פרוטופלסטים מבודדים דוגרו עם ריאגנט פלואורסצנטי מולקולה קטנה (פלואו-4/AM) במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הבדיקות הפלואורסצנטיות הכתימו בהצלחה את Ca2+ הציטוזולי, אך לא הצטברו בווליות. La3+, חוסם ערוץ Ca2+ , ירד עוצמת פלואורסצנטיות ציטופלסמית. תוצאות אלה מציעות כי Fluo-4/AM ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים Ca ציטוטוסולי2 + בבשר הפרי. לסיכום, אנו מציגים שיטה לבודד ביעילות פרוטופלסטים מתאי בשר של הפרי ולזהות Ca2+ על ידי טעינת ריאגנט סידן פלואורסצנטי במולקולה קטנה בציטופלסמה של תאי עיסת.
Ca2 + ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות צמחים ומטבוליזם1,2. כמו כן, הוא מסדיר תכונות איכות פירות3,4 , כוללקשיות,תכולת הסוכר, ורגישות להפרעות פיזיולוגיות במהלך אחסון5,6. ציטופלסמי Ca2+ ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות ומווסת את צמיחת הצמח ופיתוח7. הפרעה של הומאוסטזיס סידן הסלולר יכול לגרום לבור מר בתפוחים8, מחלת כתם חום באגסים9, וריקבון טבור בעגבניות10, המשפיעים על איכות הפרי וגורמים להפסדים כלכליים חמורים3,11. להדמיית סידן יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית מספקת והיא שיטה חשובה להתבוננות בדינמיקה Ca2+ בתאים חיים12,13.
נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות להדמיית סידן תאי בתאים חיים: האחת משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות קטנות-מולקולריות כימיות14, והשנייה היא חיישן קידוד הגנים (GECI)15,16. בהתחשב בקושי להקים מערכת מהונדסת יציבה בעצי פרי ופיתוח פירות ארוך יותר, GECIS אינו מתאים להדמיית פלואורסצנטיות של פירות Ca2+ .
למולקולות פלואורסצנטיות קטנות כגון Fluo-4/AM יש יתרון מסוים: צורת אסתר AM שלהן (נגזרת אסתר אצטוקסימתיל חדיר לתא) יכולה להיות נטענת בקלות בתפזורת לתאים חיים ללא צורך בהדבקה, מה שהופך אותה לגמישה, מהירה ולא ציטוקסית17. Fluo-4/AM יכול להיות טעון בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia18 ו Petunia,19, כמו גם לתוך תאי שמירה20 ושיער שורש של Arabidopsis21.
נכון לעכשיו, ישנם דיווחים מעטים על הכתמת פלואורסצנטיות סידן של תאי עיסת22. כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוחים. עצי תפוח מוכרים ברחבי העולם כמין כלכלי חשוב, ותפוחים נחשבים למזון בריא23. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא מעיסת פירות תפוחים דרך הידרוליזה אנזימטית ולאחר מכן העמסנו ריאגנטים פלואורסצנטיים של מולקולות קטנות לתוך הציטופלסמה כדי לזהות Ca2 +.
במחקר זה, פרוטופלסטים קיימא התקבלו על ידי הידרוליזה אנזימטית. שימו לב כי שיטה זו דורשת תפוחים טריים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בידוד מהיר של מספר רב של פרוטופלסטים מעיסת פירות לשימוש במחקרים. תחולתה של שיטה זו אינה מוגבלת ל’פוג’י’; את הפרוטופלסטים של עיסת התפוחים של ‘Dounan’ ו’דבש קריספ’ ניתן לחלץ ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט שיפור המגוון החקלאי של מחוז שאנדונג (2019LZGC007) וצוות החדשנות של עץ הפירות של מערכת הטכנולוגיה המודרנית של התעשייה החקלאית בשאנדונג (SDAIT-06-05).
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |