RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Summary

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

Abstract

A técnica de criação de perfil ribossomo (RIBO-seq) é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método, em comparação com outras abordagens, é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos em uma transcrição mRNA.

Neste artigo, descrevemos as etapas consecutivas de coleta e preparação da amostra para o método RIBO-seq em bactérias, destacando os detalhes relevantes para o planejamento e execução do experimento.

Uma vez que o RIBO-seq conta com ribossomos intactos e mRNAs relacionados, o passo chave é a rápida inibição da tradução e a desintegração adequada das células. Assim, sugerimos filtração e congelamento de flash em nitrogênio líquido para colheita celular com um pré-tratamento opcional com clororamfenícol para prender a tradução em bactérias. Para a desintegração, propomos moer células congeladas com argamassa e pilão na presença de óxido de alumínio para interromper mecanicamente a parede celular. Neste protocolo, não é necessária uma almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação gradiente de sacarose para purificação monossótil. Em vez disso, a separação mRNA usando eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) seguida pela excisão da pegada ribossômica (banda 28-30 nt) é aplicada e fornece resultados satisfatórios. Isso simplifica em grande parte o método, bem como reduz os requisitos de tempo e equipamento para o procedimento. Para a preparação da biblioteca, recomendamos usar o kit RNA pequeno disponível comercialmente para sequenciamento de illumina da New England Biolabs, seguindo as diretrizes do fabricante com algum grau de otimização.

As bibliotecas cDNA resultantes apresentam quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração (NGS). O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com os resultados do protocolo descrito em leituras mapeadas exclusivamente por amostra fornece dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é rápido e relativamente fácil e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.

Introduction

A técnica de perfil ribossomo (RIBO-seq) foi desenvolvida no laboratório de Jonathan Weissman na Universidade da Califórnia, São Francisco¹. Em comparação com outros métodos usados para estudar a expressão genética no nível translacional, RIBO-seq concentra-se em cada ligação ribossosome ao mRNA e fornece informações sobre sua localização e o número relativo de ribossomos em uma transcrição. Permite monitorar o processo de síntese proteica in vivo e pode fornecer resolução e precisão de códon único permitindo a medição da densidade ribossomo em ambos, o mRNA individual e ao longo de todo o transcriptome na célula. Na base da técnica RIBO-seq está o fato de que durante a tradução o ribossomo liga a molécula de mRNA e, assim, protege o fragmento enterrado da transcrição de uma digestão ribonuclease. Após a adição da ribonuclease, o mRNA desprotegido é digerido e os fragmentos fechados por ribossomos – tipicamente de ~28-30 nt de comprimento – permanecem intactos. Esses fragmentos, chamados pegadas ribossômicas (RF), podem então ser isolados, sequenciados e mapeados na transcrição de que se originaram resultando na detecção da posição exata dos ribossomos. De fato, a capacidade ribossômica de proteger fragmentos de mRNA tem sido usada desde a década de 1960 para estudar os locais de iniciação de ligação ribossômica e tradução (TIS)^2,3,4. No entanto, com o avanço da tecnologia de sequenciamento profundo, o RIBO-seq tornou-se um padrão ouro para o monitoramento de tradução⁵ que, através do engajamento ribossomo, pode fornecer uma informação em todo o genoma sobre a^{síntese de}proteínas 6 . O perfil ribossomo preencheu a lacuna tecnológica existente entre quantificar o transcriptome e o proteome⁶.

Para realizar o perfil ribossomo precisamos obter lisecelulares do organismo que cresceu sob as condições investigadas. Interromper essas condições durante a coleta e lise celular pode fornecer dados não confiáveis. Para evitar isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. As células podem ser lístidas pela moagem criogênica em um homogeneizador mecânico como um moinho de batedeira^7,8 ou um batedor de contas⁹, e por trituração através de uma pipeta¹⁰ ou com uma agulha¹¹. O tampão de lise pode ser adicionado pouco antes ou pouco depois da pulverização das células. Em nosso protocolo usamos nitrogênio líquido para argamassa pré-colono e pilão, bem como óxido de alumínio como uma abordagem mais suave para a interrupção da parede celular bacteriana, o que impede a tesoura de RNA frequentemente encontrada quando métodos como a sonificação são aplicados. Após a pulverização, adicionamos um tampão de lise gelada no conteúdo resfriado da argamassa. A seleção de um tampão de lise apropriado é importante para obter a melhor resolução de pegadas ribossômicas. Uma vez que a força iônica afeta tanto o tamanho do RF quanto a precisão do quadro de leitura, recomenda-se atualmente o uso de tampões de lise com baixa resistência iônica e capacidade de tampão, mesmo que pareça que a composição do buffer não afeta a ocupação ribossômica em mRNAs^11,12. Componentes importantes do tampão de lise são íons de magnésio, a presença que impede a dissociação das subunidades ribossômicas e inibe alterações conformais espontâneas nos ribossomos bacterianos^11,13. Os íons de cálcio também desempenham um papel significativo e são essenciais para a atividade da nuclease microcócica (MNase) utilizada no método de perfil ribossomo bacteriano¹⁴. Adição de guanosina 5′-[β,γ-imido]triphosfato (GMP-PNP), um análogo não hidroglizável do GTP, juntamente com o clorofenicol inibe a tradução durante a lise¹⁵.

Quando o lisato é obtido, ele é esclarecido por centrifugação e dividido em duas porções, cada uma para um RIBO-seq e um sequenciamento de mRNA total de alta produtividade (RNA-seq) uma vez que são realizados simultaneamente(Figura 1). O RNA-seq fornece um ponto de referência que permite a comparação de dados tanto do RIBO-seq quanto do RNA-seq durante a análise dos dados. O translatome investigado é definido pela normalização das pegadas ribossômicas à abundância de mRNA¹⁶. Os dados do RNA-seq também podem ajudar a identificar a clonagem ou sequenciamento de artefatos¹⁷.

Figura 1. Esquemas de preparação de amostras de mRNA para RIBO-seq e RNA-seq. Para a preparação da biblioteca RIBO-seq, o RNA é digerido com MNase (A), seguido pela seleção de tamanho de RF de ~28-30 nt de comprimento (B); para RNA-seq RNA é isolado (C), esgotado de rRNA (D), e o mRNA resultante é aleatoriamente fragmentado em fragmentos de comprimentos variados (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As etapas iniciais do procedimento de preparação da amostra para RIBO-seq e RNA-seq diferem ligeiramente(Figura 1). Para o perfil ribossômico, o liseto precisa ser digerido por uma endonuclease específica para degradar as moléculas de mRNA não protegidas pelos ribossomos. Nos protocolos padrão, os monossomos obtidos são recuperados por uma ultracentrifugação de almofada de sacarose ou uma ultracentrifugação de gradiente de sacarose^8,14. Neste artigo, mostramos que esta etapa não é necessária para isolar a RF necessária para o RIBO-seq em bactérias, da mesma forma para as células eucarióticas¹⁸, e que a seleção de tamanho dos fragmentos de comprimento apropriado do gel de poliacrilamida é suficiente.

Para RNA-seq, o mRNA é obtido pelo esgotamento do rRNA do total de moléculas de RNA – rRNA hibridizem-se às sondas oligonucleotidas biotinínas que se ligam às contas magnéticas revestidas de streptavidin. Os complexos rRNA-oligonucleotídeo-contas são então removidos da amostra com um ímã resultando em uma amostra esgotada de rRNA^19,20. As moléculas de mRNA purificadas são então fragmentadas aleatoriamente por hidrólise alcalina. Os fragmentos obtidos de mRNA, bem como as pegadas ribossômicas são convertidos em bibliotecas cDNA e preparados para sequenciamento profundo(Figura 2). Isso envolve o reparo necessário após a hidrólise alcalina (para mRNA) e digestão enzimática (para RF): desfosforilação de extremidades de 3′ seguida de fosforilação de extremidades de 5′. Os próximos passos são a ligadura dos adaptadores e a transcrição reversa para criar inserções cDNA emolduradas por sequências necessárias para o sequenciamento de próxima geração (NGS) usando a plataforma Illumina. A última fase da preparação da biblioteca é uma reação pcr na qual os construtos são amplificados e rotulados com códigos de barras específicos de amostra para permitir multiplexagem e sequenciamento de várias amostras em um único canal. Antes do sequenciamento, a qualidade e a quantidade das bibliotecas são avaliadas pelo DNA de alta sensibilidade na eletroforese do chip. bibliotecas cDNA com parâmetros apropriados podem então ser agrupadas e sequenciadas. O sequenciamento pode ser realizado em diferentes plataformas de Illumina, como MiSeq, NextSeq ou HighSeq, dependendo do número de bibliotecas, comprimento de leitura necessário e profundidade de sequenciamento. Após o sequenciamento, a análise bioinformática é realizada.

Figura 2. Preparação da biblioteca. A preparação da biblioteca inclui o reparo de extremidades, ligadura dos adaptadores, transcrição reversa e amplificação com codificação de barras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O perfil ribossomo é um método universal que pode ser facilmente modificado e ajustado de acordo com a questão científica. Originalmente foi usado na levedura¹, mas logo depois foi aplicado às células bacterianas^21, bem como organismos modelo eucarióticos, incluindo camundongos^10,zebrafish²², mosca de frutas²³ e Arabidopsis thaliana²⁴. Também foi utilizado para o estudo de diferentes tipos ribossósmicos: citoplasmásmico, mitocondrial^25,26 e cloroplasto^27,28. Em eucariotes RIBO-seq é comumente adaptado e refinado para investigar aspectos específicos da tradução, incluindo iniciação^{10,11,29,30,31,32}, alongamento^{1,10,11,31,33}, ribossomo parando³³ e alteração de conformação³³. A maioria das modificações envolve o uso de diferentes inibidores de tradução. No entanto, nas bactérias, estudos análogos têm sido difíceis de realizar devido à escassez de inibidores com o mecanismo de ação necessário³⁴. O inibidor de tradução mais usado em bactérias é o clorofífenicol (CAM), que se liga ao centro de transferência de peptidyl (PTC) e impede o posicionamento correto do aminoacílico-tRNA no local A. Como resultado, cam impede a formação de um vínculo peptídeo que leva à prisão dos ribossomos^{alongamentos 35}. Outros exemplos de inibidores de tradução em bactérias são a tetraciclina (TET)³⁶, retapamulina (RET)³⁴ e Onc112³⁷ que foram usados para investigar sites de iniciação de tradução. O TET, que impede a entrega de tRNA ao ribossomo, sobrepondo-se diretamente com o loop anticodon de tRNA no local A, foi originalmente aplicado para verificar os resultados obtidos do tratamento CAM, uma vez que ambos são antibióticos inibindo a alongamento da tradução³⁸. Foi encontrado tet para detectar TIS primário, no entanto foi incapaz de revelar TIS³⁶interno . RET se liga no PTC do ribossomo bacteriano, e impede a formação da primeira ligação de peptídeo interferindo com um alongador aminoacyl-tRNA no site A. A aplicação de RET resulta em prisão de ribossomos tanto nas TISs primárias quanto internas³⁴. Onc112, um peptídeo antimicrobiano rico em proline, liga-se no túnel de saída e bloqueia a ligação aminoacíl-tRNA no local ribossômico A. Como resultado, o Onc112 impede que os complexos de iniciação entrem na fase de alongamento³⁷.

A principal informação que o perfil ribossomo fornece é a densidade de ribossomos e sua posição no mRNA. Foi aplicado com sucesso para investigar a expressão genética diferencial no nível da tradução em várias condições de crescimento^1,6, medir a eficiência translacional^1,38,39 e detectar eventos de regulação de tradução, como a pausa ribossômica¹⁰. RIBO-seq também permite descobrir a tradução de ncRNA anotado, pseudogenes e pequenos quadros de leitura abertos não anotados (ORF) levando à identificação de genes de codificação de proteínas novos e/ou muito curtos^{10,12,22,30,37}. Nesses casos, ribo-seq pode ajustar e melhorar a anotação do genoma. Com sua alta sensibilidade para a identificação de ORFs traduzidos e sua natureza quantitativa, o perfil ribossomo também pode servir como proxy para a determinação proteome ou para auxiliar estudos de proteômica^31,34,39. Ao mapear o TIS, o perfil ribossomo revela isóformes n-terminalmente estendidos e truncados de proteínas conhecidas^10,32. RIBO-seq também foi adaptado para estudar o dobrável co-translacional das proteínas^14,21,24. Este método permite medir as taxas de alongamento^1,10,39 ou velocidades de decodificação de códons individuais⁶ e ajuda no desenvolvimento de modelos quantitativos de tradução¹⁷. O método de criação de perfil ribossomo também é capaz de fornecer insights mecanicistas sobre a pausa ribossa em bactérias^7,15,17, frameshifting⁴⁰, stop-codon readthrough²¹, defeitos de terminação/reciclagem^41,42 e alterações de conformação ribossômica³³ em eucariotos. RIBO-seq também foi adaptado para examinar o impacto de fatores trans-acionados específicos na tradução, como miRNAs⁶ e proteínas de ligação de RNA em eucariotes^16,43. No entanto, é importante reconhecer que o projeto experimental e a resolução obtida do RIBO-seq determinam a quantidade de informações que podem ser extraídas dos dados de sequenciamento^{resultantes 12}.

Protocol

1. Coleta de amostras Prepare uma cultura bacteriana. Recomendamos um volume cultural de 100 mL por amostra. Preparar equipamentos e reagentes para coleta de amostras: duas scoopulas por amostra, filtros de membrana de ésteres de celulose mista (MCE) de 0,45 μm, tubos estéreis de 50 mL, nitrogênio líquido, 50 mg/mLram clorofenicol em 70% (vol/vol) de etanol (opcional). Puna a tampa de tubos de 50 mL para permitir a evaporação de nitrogênio líquido e evitar a explosão de tubos fechados. Desco…

Representative Results

Os resultados exemplares aqui apresentados foram obtidos em estudo que examinou a regulação da tradução na esporosulação das células subtilis WT Bacillus. As culturas durante a noite foram diluídas para OD600 igual a 0,1 em 100 mL de médio rico e incubadas a 37 °C com agitação vigorosa até OD600 atingir 0,5-0,6. O meio rico foi então substituído por meio mínimo para induzir processo de esporulação e a incubação foi continuada por até quatro horas. As células eram colhi…

Discussion

O principal desafio técnico do perfil ribossomo é a necessidade de inibir rapidamente a tradução para capturar um instantâneo de ribossomos em mRNAs em um determinado estado fisiológico de interesse. Para isso, inibidores de tradução, colheita rápida e congelamento de flash em nitrogênio líquido são comumente usados. A aplicação de antibióticos é opcional, pois podem causar artefatos. Chloramphenicol é uma droga comumente usada para prender ribossomos alongamentos em RIBO-seq bacteriana. No entanto, não…

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0