RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Natalia Kopik; Olga Chrobak; Przemyslaw Latoch; Mariia Kovalenko; Agata L. Starosta

doi:10.3791/62544

JoVE Journal > Biochemistry

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Biochimica

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Published: August 07, 2021

doi:

10.3791/62544

Natalia Kopik², Olga Chrobak², Przemyslaw Latoch³, Mariia Kovalenko², Agata L. Starosta²

¹Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex,Maria Curie-Sklodowska University, ²Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences,Maria Curie-Sklodowska University, ³Faculty of Information Technology,Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

Abstract

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.

Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.

Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.

Introduction

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) wurde im Labor von Jonathan Weissman an der University of California, San Francisco¹entwickelt. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Genexpression auf translationaler Ebene konzentriert sich RIBO-seq auf jede Ribosombindung an mRNA und liefert Informationen über seine Position und die relative Anzahl der Ribosomen auf einem Transkript. Es ermöglicht die Überwachung des Prozesses der Proteinsynthese in vivo und kann eine einzelne Codonauflösung und -genauigkeit liefern, die die Messung der Ribosomendichte sowohl auf der einzelnen mRNA als auch entlang des gesamten Transkriptoms in der Zelle ermöglicht. Grundlage der RIBO-seq-Technik ist die Tatsache, dass das Ribosom während der Translation das mRNA-Molekül bindet und so das vergrabene Fragment des Transkripts vor einer Ribonuklease-Verdauung schützt. Nach Zugabe der Ribonuklease wird die ungeschützte mRNA verdaut und die von Ribosomen eingeschlossenen Fragmente – typischerweise von ~28-30 nt lang – bleiben intakt. Diese Fragmente, die als ribosomale Fußabdrücke (RF) bezeichnet werden, können dann isoliert, sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Erkennung der genauen Position der Ribosomen führt. Tatsächlich wird die Ribosomenfähigkeit zum Schutz von mRNA-Fragmenten seit den 1960er Jahren verwendet, um ribosomale Bindungs- und Translationsinitiierungsstellen (TIS)²^,³^,⁴zu untersuchen. Mit dem Fortschritt in der Tiefensequenzierungstechnologie ist RIBO-seq jedoch zu einem Goldstandard für die Translationsüberwachung^{geworden 5,} der durch das Ribosomengagement genomweite Informationen über die Proteinsynthese liefern kann⁶. Ribosomenprofilierung füllte die technologische Lücke, die zwischen der Quantifizierung des Transkriptoms und des Proteoms bestand⁶.

Um ein Ribosomen-Profiling durchzuführen, müssen wir Zelllysat des Organismus erhalten, der unter den untersuchten Bedingungen gewachsen war. Die Störung dieser Bedingungen während der Zellentnahme und -lyse kann unzuverlässige Daten liefern. Um dies zu verhindern, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Zellen können durch kryogenes Mahlen in einem mechanischen Homogenisator wie einer Mischermühle⁷^,8 oder^einem Perlenschläger⁹und durch Trituration durch eine Pipette¹⁰ oder mit einer Nadel¹¹lysiert werden. Der Lysepuffer kann kurz vor oder kurz nach der Pulverisierung der Zellen zugegeben werden. In unserem Protokoll verwenden wir flüssigen Stickstoff zur Vorkühlung von Mörtel und Stößel sowie Aluminiumoxid als schonenderen Ansatz zur Störung der bakteriellen Zellwand, was eine RNA-Scherung verhindert, die häufig bei Methoden wie sonifikation auftritt. Nach der Pulverisierung fügen wir dem gekühlten Inhalt des Mörtels einen eiskalten Lysepuffer hinzu. Die Auswahl eines geeigneten Lysepuffers ist wichtig, um die beste Auflösung der ribosomalen Fußabdrücke zu erhalten. Da die Ionenstärke sowohl die HF-Größe als auch die Leserahmengenauigkeit beeinflusst, wird derzeit empfohlen, Lysepuffer mit geringer Ionenstärke und Pufferkapazität zu verwenden, auch wenn es den Anschein hat, dass die Pufferzusammensetzung die ribosomale Belegung auf mRNAs¹¹^,¹²nicht beeinflusst. Wichtige Bestandteile des Lysepuffers sind Magnesiumionen, deren Vorhandensein eine Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten verhindert und spontane Konformationsveränderungen in den bakteriellen Ribosomen hemmt¹¹^,¹³. Calciumionen spielen ebenfalls eine bedeutende Rolle und sind essentiell für die Aktivität der Mikrokokkennuklease (MNase), die in der bakteriellen Ribosomenprofilierungsmethode verwendet wird¹⁴. Die Zugabe von Guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosphat (GMP-PNP), einem nicht hydrolysierbaren Analogon von GTP, zusammen mit Chloramphenicol hemmt die Translation während der Lyse^15.

Wenn das Lysat erhalten wird, wird es durch Zentrifugation geklärt und in zwei Portionen unterteilt, jeweils für eine RIBO-seq- und eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung (RNA-seq), da sie gleichzeitig durchgeführt werden (Abbildung 1). RNA-seq bietet einen Bezugspunkt, der den Vergleich von Daten sowohl von RIBO-seq als auch von RNA-seq während der Datenanalyse ermöglicht. Das untersuchte Translatom wird durch Normalisierung ribosomaler Fußabdrücke zur mRNA-Häufigkeit^{definiert 16}. Daten von RNA-seq können auch helfen, Klon- oder Sequenzierungsartefakte zu identifizieren¹⁷.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der mRNA-Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq. Für die RIBO-seq-Bibliotheksvorbereitung wird RNA mit MNase (A) verdaut, gefolgt von der Größenauswahl von RF von ~ 28-30 nt Länge (B); für RNA-seq wird RNA isoliert (C), von rRNA (D) erschöpft und die resultierende mRNA wird zufällig in Fragmente unterschiedlicher Länge (E) fragmentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die ersten Schritte des Verfahrens der Probenvorbereitung für RIBO-seq und RNA-seq unterscheiden sich geringfügig (Abbildung 1). Für das ribosomale Profiling muss das Lysat durch eine spezifische Endonuklease verdaut werden, um die mRNA-Moleküle abzubauen, die nicht durch die Ribosomen geschützt sind. In Standardprotokollen werden die erhaltenen Monosomen durch eine Saccharosekissen-Ultrazentrifugation oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation⁸,¹⁴zurückgewonnen. In diesem Artikel zeigen wir, dass dieser Schritt nicht notwendig ist, um RF zu isolieren, die für das RIBO-seq in Bakterien erforderlich sind, ebenso für eukaryotische Zellen¹⁸, und dass die Größenauswahl der geeigneten mRNA-Fragmente aus dem Polyacrylamid-Gel ausreichend ist.

Für RNA-seq wird mRNA durch die Erschöpfung von rRNA aus der gesamten RNA erhalten – rRNA-Moleküle hybridisieren zu den biotinylierten Oligonukleotidsonden, die an die Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen binden. Die rRNA-Oligonukleotid-Perlenkomplexe werden dann mit einem Magneten aus der Probe^entfernt,was zu einer rRNA-erschöpften Probe¹⁹,²⁰führt. Die gereinigten mRNA-Moleküle werden dann durch alkalische Hydrolyse zufällig fragmentiert. Die erhaltenen Fragmente der mRNA sowie die ribosomalen Fußabdrücke werden in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und für die Tiefensequenzierung vorbereitet (Abbildung 2). Dies beinhaltet die Reparatur der Enden, die nach der alkalischen Hydrolyse (für mRNA) und der enzymatischen Verdauung (für RF) erforderlich ist: Dephosphorylierung von 3′-Enden, gefolgt von Phosphorylierung von 5′-Enden. Die nächsten Schritte sind die Adapterligatur und die umgekehrte Transkription, um cDNA-Inserts zu erstellen, die von Sequenzen umrahmt werden, die für die Next Generation Sequencing (NGS) mit der Illumina-Plattform erforderlich sind. Die letzte Phase der Bibliotheksvorbereitung ist eine PCR-Reaktion, bei der die Konstrukte amplifiziert und mit probenspezifischen Barcodes markiert werden, um multiplexen und sequenzieren zu können, verschiedene Proben auf einem Kanal zu sequenzieren. Vor der Sequenzierung werden Qualität und Quantität der Bibliotheken durch die hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bewertet. cDNA-Bibliotheken mit entsprechenden Parametern können dann gepoolt und sequenziert werden. Die Sequenzierung kann auf verschiedenen Illumina-Plattformen wie MiSeq, NextSeq oder HighSeq durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Bibliotheken, der erforderlichen Leselänge und der Sequenzierungstiefe. Nach der Sequenzierung wird die bioinformatische Analyse durchgeführt.

Abbildung 2. Bibliotheksvorbereitung. Die Bibliotheksvorbereitung umfasst die Reparatur der Enden, die Ligatur der Adapter, die umgekehrte Transkription und die Verstärkung mit Barcoding. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ribosomenprofilierung ist eine universelle Methode, die sich leicht modifizieren und entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung anpassen lässt. Ursprünglich wurde es in Hefe¹verwendet, aber kurz darauf wurde es auf Bakterienzellen²¹ sowie eukaryotische Modellorganismen wie Maus^10,Zebrafisch^22,Fruchtfliege²³ und Arabidopsis thaliana²⁴aufgetragen. Es wurde auch für die Untersuchung verschiedener Ribosomentypen verwendet: zytoplasmatische, mitochondriale²⁵^,²⁶ und Chloroplast²⁷^,²⁸. Bei Eukaryoten wird RIBO-seq üblicherweise angepasst und verfeinert, um spezifische Aspekte der Translation zu untersuchen, einschließlich Initiation¹⁰^,¹¹^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³², Dehnung¹^,¹⁰^,¹¹^,³¹^,³³, Ribosomenabwürgen³³ und Konformationsänderung³³. Die meisten Modifikationen beinhalten die Verwendung verschiedener Translationsinhibitoren. Bei Bakterien waren analoge Studien jedoch aufgrund des Mangels an Inhibitoren mit dem erforderlichen Wirkmechanismus schwierig^{durchzuführen 34}. Der am häufigsten verwendete Translationsinhibitor in Bakterien ist Chloramphenicol (CAM), das an das Peptidyltransferase-Zentrum (PTC) bindet und eine korrekte Positionierung der Aminoacyl-tRNA in der A-Stelle verhindert. Infolgedessen verhindert CAM die Bildung einer Peptidbindung, die dazu führt, dass die länglichen Ribosomen³⁵blockiert werden. Weitere Beispiele für Translationsinhibitoren in Bakterien sind Tetracyclin (TET)³⁶, Retapamulin (RET)³⁴ und Onc112^37, die zur Untersuchung von Translationsinitiierungsstellen verwendet wurden. TET, das die tRNA-Abgabe an das Ribosom verhindert, indem es sich direkt mit der Anticodon-Stammschleife der tRNA an der A-Stelle überschneidet, wurde ursprünglich angewendet, um die Ergebnisse der CAM-Behandlung zu überprüfen, da beide Antibiotika sind, die die Translationsdehnung hemmen³⁸. Es wurde festgestellt, dass TET primäre TIS erkennt, konnte jedoch kein internes TIS³⁶aufdecken. RET bindet im PTC des bakteriellen Ribosoms und verhindert die Bildung der ersten Peptidbindung, indem es mit einer Elongator-Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle interferiert. Die Anwendung von RET führt zu einem Ribosomen-Arrest sowohl bei primären als auch bei internen TISs³⁴. Onc112, ein prolinreiches antimikrobielles Peptid, bindet im Austrittstunnel und blockiert die Aminoacyl-tRNA-Bindung an der ribosomalen A-Stelle. Dadurch verhindert Onc112, dass Initiationskomplexe in die Dehnungsphase³⁷eintreten.

Die Hauptinformation, die das Ribosomen-Profiling liefert, ist die Ribosomendichte und ihre Position auf der mRNA. Es wurde erfolgreich angewendet, um die differentielle Genexpression auf der Ebene der Translation in verschiedenen Wachstumsbedingungen¹^,⁶zu untersuchen, die translationale Effizienz¹^,³⁸^,³⁹ zu messen und Translationsregulationsereignisse wie ribosomale Pausierung¹⁰zu erkennen. RIBO-seq ermöglicht auch die Aufdeckung der Translation von annotierter ncRNA, Pseudogenen und unangekündigten kleinen offenen Leserahmen (ORF), die zur Identifizierung neuer und/oder sehr kurzer proteinkodierender Gene¹⁰^,¹²^,²²^,³⁰^,³⁷führen. In solchen Fällen kann RIBO-seq die Genomannotation verfeinern und verbessern. Mit seiner hohen Sensitivität für die Identifizierung übersetzter ORFs und seiner quantitativen Natur kann das Ribosomen-Profiling auch als Proxy für die Proteombestimmung oder zur Unterstützung von Proteomik-Studien^{dienen 31}^,³⁴^,³⁹. Durch die Kartierung von TIS zeigt das Ribosomen-Profiling N-terminal ausgedehnte und abgeschnittene Isoformen bekannter Proteine¹⁰^,³². RIBO-seq wurde auch angepasst, um die co-translationale Faltung der Proteine¹⁴^,²¹^,²⁴zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Dehnungsraten¹^,¹⁰^,³⁹ oder Dekodierungsgeschwindigkeiten einzelner Codons⁶ und hilft bei der Entwicklung quantitativer Modelle der Übersetzung¹⁷. Die Ribosomen-Profiling-Methode ist auch in der Lage, mechanistische Einblicke in die Ribosomen-Pause bei Bakterien⁷^,¹⁵^,¹⁷, Frameshifting⁴⁰, Stop-Codon-Readthrough²¹, Abschluss- / Recyclingdefekte⁴¹^,⁴² und ribosomale Konformationsänderungen³³ in Eukaryoten zu liefern. RIBO-seq wurde auch angepasst, um den Einfluss spezifischer trans-wirkender Faktoren auf die Translation wie miRNAs⁶ und RNA-bindende Proteine in Eukaryoten¹⁶,⁴³^zuuntersuchen. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass das experimentelle Design und die erhaltene Auflösung von RIBO-seq die Menge an Informationen bestimmen, die aus den resultierenden Sequenzierungsdaten extrahiert werden können¹².

Protocol

1. Probenentnahme Bereiten Sie eine Bakterienkultur vor. Wir empfehlen ein Kulturvolumen von 100 ml pro Probe. Vorbereitung von Geräten und Reagenzien für die Probenentnahme: zwei Messlöffel pro Probe, sterile 0,45 μm McE-Filter (Mixed Cellulose esters Membrane), 50 ml sterile Röhrchen, flüssiger Stickstoff, 50 mg/ml Chloramphenicol in 70% (vol/vol) Ethanol (optional). Durchstechen Sie den Deckel von 50-ml-Rohren, um die Verdunstung von flüssigem Stickstoff zu ermöglichen und die Explosion ges…

Representative Results

Die hier vorgestellten exemplarischen Ergebnisse wurden in einer Studie zur Translationsregulation in sporulierenden WT Bacillus subtilis Zellen erzielt. Über Nachtkulturen wurden auf OD600 entsprechend 0,1 in 100 ml reichhaltigem Medium verdünnt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert, bis OD600 0,5-0,6 erreichte. Das reichhaltige Medium wurde dann durch minimales Medium ersetzt, um den Sporulationsprozess zu induzieren, und die Inkubation wurde für bis zu vier Stunden fort…

Discussion

Die wichtigste technische Herausforderung des Ribosomen-Profilings besteht in der Notwendigkeit, die Translation schnell zu hemmen, um eine Momentaufnahme von Ribosomen auf mRNAs in einem bestimmten physiologischen Zustand von Interesse zu erfassen. Um dies zu erreichen, werden häufig Translationsinhibitoren, schnelle Ernte und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff verwendet. Die Anwendung von Antibiotika ist optional, da sie Artefakte verursachen können. Chloramphenicol ist ein häufig verwendetes Medikament, um l?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ALS möchte die finanzielle Unterstützung der EMBO Installation Grants IG 3914 und POIR anerkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 durchgeführt im Rahmen des Programms First TEAM der Stiftung für polnische Wissenschaft, das von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung kofinanziert wird.

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8% Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0

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Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).