RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og bibliotekforberedelsesprotokoll for NGS-sekvensering

Summary

Her beskriver vi stadier av prøvetaking og forberedelse for RIBO-seq i bakterier. Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til disse retningslinjene resulterer i tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er enkel, bruker standard laboratorieutstyr og tar syv dager fra lysis til å skaffe biblioteker.

Abstract

Ribosomets profileringsteknikk (RIBO-seq) er for tiden det mest effektive verktøyet for å studere prosessen med proteinsyntese in vivo. Fordelen med denne metoden, sammenlignet med andre tilnærminger, er dens evne til å overvåke oversettelse ved å kartlegge nøyaktig plasseringen og antall ribosomer på en mRNA-transkripsjon.

I denne artikkelen beskriver vi de påfølgende stadiene av prøveinnsamling og forberedelse for RIBO-seq-metoden i bakterier, og fremhever detaljene som er relevante for planlegging og gjennomføring av eksperimentet.

Siden RIBO-seq er avhengig av intakte ribosomer og relaterte mRNAer, er nøkkeltrinnet rask hemming av oversettelse og tilstrekkelig oppløsning av celler. Dermed foreslår vi filtrering og flash-frysing i flytende nitrogen for cellehøsting med en valgfri forbehandling med kloramfenikol for å arrestere oversettelse i bakterier. For oppløsningen foreslår vi sliping av frosne celler med mørtel og pestle i nærvær av aluminiumoksid for å forstyrre celleveggen mekanisk. I denne protokollen er det ikke nødvendig med sukrosepute eller en sukrose gradient ultracentrifugation for monosom rensing. I stedet påføres mRNA-separasjon ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) etterfulgt av det ribosomale fotavtrykket (28-30 nt-bånd) og gir tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i stor grad metoden, samt reduserer tids- og utstyrskravene for prosedyren. For bibliotekforberedelse anbefaler vi at du bruker det kommersielt tilgjengelige lille RNA-settet for Illumina-sekvensering fra New England Biolabs, etter produsentens retningslinjer med en viss grad av optimalisering.

De resulterende cDNA-bibliotekene presenterer passende mengde og kvalitet som kreves for neste generasjons sekvensering (NGS). Sekvensering av bibliotekene utarbeidet i henhold til de beskrevne protokollresultatene i 2 til 10 mln unikt kartlagte lesninger per prøve som gir tilstrekkelige data for omfattende bioinformatisk analyse. Protokollen vi presenterer er rask og relativt enkel og kan utføres med standard laboratorieutstyr.

Introduction

Ribosomprofileringsteknikken (RIBO-seq) ble utviklet i laboratoriet til Jonathan Weissman ved University of California, San Francisco¹. Sammenlignet med andre metoder som brukes til å studere genuttrykk på translasjonsnivå, fokuserer RIBO-seq på hvert ribosome som binder seg til mRNA og gir informasjon om plasseringen og det relative antallet ribosomer på en transkripsjon. Det muliggjør overvåking av prosessen med proteinsyntese in vivo og kan gi enkel kodonoppløsning og nøyaktighet som tillater måling av ribosomets tetthet på begge, den enkelte mRNA og langs hele transkripsjonen i cellen. Ved grunnlaget for RIBO-seq-teknikken ligger det faktum at ribbeosomet under oversettelse binder mRNA-molekylet og dermed beskytter det begravde fragmentet av transkripsjonen fra en ribonuklease fordøyelse. Ved tilsetning av ribonuklease fordøyes den ubeskyttede mRNA og fragmentene vedlagt av ribosomer – vanligvis ~ 28-30 nt lange – forblir intakte. Disse fragmentene, kalt ribosomale fotavtrykk (RF), kan deretter isoleres, sekvenseres og kartlegges på transkripsjonen de stammer fra, noe som resulterer i deteksjon av ribosomenes nøyaktige posisjon. Faktisk har ribososom evnen til å beskytte mRNA fragmenter blitt brukt siden 1960-tallet for å studere ribosomal binding og oversettelse initieringssteder (TIS)^2,3,4. Men med fremskrittet i dyp sekvenseringsteknologi har RIBO-seq blitt en gullstandard for oversettelsesovervåking⁵ som gjennom ribosomets engasjement kan gi en genom-bred informasjon om proteinsyntese⁶. Ribosomprofilering fylte det teknologiske gapet som eksisterte mellom kvantifisering av transkripsjonen og proteomet⁶.

For å gjennomføre ribosomprofilering må vi få cellelys av organismen som hadde vokst under de undersøkte forholdene. Å forstyrre disse forholdene under celleinnsamling og lysis kan gi upålitelige data. For å forhindre dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Celler kan lyses ved kryogen sliping i en mekanisk homogenisator som en miksermølle^7,8 eller en perle beater⁹, og ved triturasjon gjennom en pipette¹⁰ eller med en nål¹¹. Lysisbufferen kan tilsetts like før eller kort tid etter pulverisering av cellene. I vår protokoll bruker vi flytende nitrogen til prekolmørtel og pestle, samt aluminiumoksid som en mildere tilnærming til forstyrrelse av bakteriell cellevegg, noe som forhindrer RNA-skjæring ofte oppstår når metoder som sonifisering påføres. Etter pulverisering legger vi til en iskald lysisbuffer i det avkjølte innholdet i mørtelet. Valg av en passende lysisbuffer er viktig for å oppnå den beste oppløsningen av ribosomale fotavtrykk. Siden ionstyrke påvirker både RF-størrelsen og leserammepresisjonen, anbefales det for tiden å bruke lysisbuffere med lav ionisk styrke og bufferkapasitet, selv om det ser ut til at buffersammensetningen ikke påvirker ribosomal belegg på mRNAs^11,12. Viktige komponenter i lysisbufferen er magnesiumioner, hvis tilstedeværelse forhindrer dissosiasjon av ribosomale underenheter og hemmer spontane konformasjonsendringer i bakterielle ribosomer^11,13. Kalsiumioner spiller også en betydelig rolle og er avgjørende for aktiviteten til mikrokokkkjerne (MNase) som brukes i bakteriell ribosomprofileringsmetode¹⁴. Tillegg av guanosin 5′-[β,γ-imido]triphosfat (GMP-PNP), en ikke-hydrolysert analog av GTP, sammen med kloramfenikol hemmer oversettelse under lysis¹⁵.

Når lysatet oppnås, avklares det ved sentrifugering og deles inn i to deler, hver for en RIBO-seq og en total mRNA-sekvensering med høy gjennomstrømning (RNA-seq) siden de utføres samtidig (figur 1). RNA-seq gir et referansepunkt som gjør det mulig å sammenligne data fra både RIBO-seq og RNA-seq under dataanalyse. Den undersøkte translatome er definert ved normalisering av ribosomale fotavtrykk til mRNA overflod¹⁶. Data fra RNA-seq kan også bidra til å identifisere kloning eller sekvensering av artefakter¹⁷.

Figur 1. Skjema for mRNA prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq. For RIBO-seq bibliotek forberedelse fordøyes RNA med MNase (A), etterfulgt av størrelsesvalget av RF på ~ 28-30 nt lengde (B); for RNA-seq RNA er isolert (C), utarmet av rRNA (D), og den resulterende mRNA fragmenteres tilfeldig i fragmenter av varierende lengde (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De første trinnene i prosedyren for prøvepreparering for RIBO-seq og RNA-seq varierer noe (figur 1). For ribosomal profilering må lysatet fordøyes av en bestemt endonuklease for å forringe mRNA-molekylene som ikke er beskyttet av ribosomene. I standardprotokoller gjenvinnes de oppnådde monosomene av en sukrosepute ultracentrifugation eller en sukrose gradient ultracentrifugation^8,14. I denne artikkelen viser vi at dette trinnet ikke er nødvendig for å isolere RF som kreves for RIBO-seq i bakterier, på samme måte for eukaryote celler¹⁸, og at størrelsesvalg av riktig lengde mRNA-fragmenter fra polyakrylamidgelen er tilstrekkelig.

For RNA-seq oppnås mRNA ved uttømming av rRNA fra de totale RNA – rRNA-molekylene hybridiserer til de biotinylerte oligonukleotidsondene som binder seg til de streptavidinbelagte magnetiske perlene. RRNA-oligonukleotid-perlekompleksene fjernes deretter fra prøven med en magnet som resulterer i en rRNA utarmet prøve^19,20. De rensede mRNA-molekylene fragmenteres deretter tilfeldig av alkalisk hydrolyse. De oppnådde fragmentene av mRNA samt ribosomale fotavtrykk konverteres til cDNA-biblioteker og fremstilles for dyp sekvensering (figur 2). Dette innebærer reparasjon av ender som trengs etter alkalisk hydrolyse (for mRNA) og enzymatisk fordøyelse (for RF): defosforylering av 3′ ender etterfulgt av fosforylering av 5′ ender. De neste trinnene er adaptere ligation og omvendt transkripsjon for å lage cDNA innsatser innrammet av sekvenser som kreves for neste generasjon sekvensering (NGS) ved hjelp av Illumina plattform. Den siste fasen av bibliotekforberedelse er en PCR-reaksjon der konstruksjonene forsterkes og merkes med prøvespesifikke strekkoder for å tillate multipleksing og sekvensering av ulike prøver på en kanal. Før sekvensering vurderes kvaliteten og mengden av bibliotekene av høysensitiv DNA on-chip elektroforese. cDNA-biblioteker med riktige parametere kan deretter grupperes og sekvenseres. Sekvensering kan utføres på forskjellige Illumina-plattformer, for eksempel MiSeq, NextSeq eller HighSeq, avhengig av antall biblioteker, nødvendig leselengde og sekvenseringsdybde. Etter sekvensering utføres den bioinformatiske analysen.

Figur 2. Klargjøring av biblioteket. Biblioteksforberedelse inkluderer endereparasjon, adaptere ligation, omvendt transkripsjon og forsterkning med barkoding. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ribosomet profilering er en universell metode som lett kan modifiseres og justeres i henhold til det vitenskapelige spørsmålet. Opprinnelig ble den brukt i gjær¹, men kort tid etter at den ble brukt på bakterieceller²¹ samt eukaryote modellorganismer, inkludert mus¹⁰, sebrafisk²², fruktflue²³ og Arabidopsis thaliana²⁴. Den ble også brukt til å studere forskjellige ribosomtyper: cytoplasmatisk, mitokondrie^25,26 og kloroplast^27,28. I eukaryoter er RIBO-seq vanligvis tilpasset og raffinert for å undersøke spesifikke aspekter ved oversettelse, inkludert initiering^{10,11,29,30,31,32}, forlengelse^{1,10,11,31,33}, ribosom stalling³³ og konformasjonsendring³³. De fleste modifikasjonene innebærer bruk av forskjellige oversettelseshemmere. I bakterier har imidlertid analoge studier vært vanskelige å gjennomføre på grunn av hemmeres paucity med den nødvendige virkningsmekanismen³⁴. Den mest brukte oversettelseshemmeren i bakterier er kloramfenikol (CAM) som binder seg til peptidyloverføringssenteret (PTC) og forhindrer riktig posisjonering av aminoacyl-tRNA på A-området. Som et resultat forhindrer CAM dannelsen av en peptidbinding som fører til å arrestere de langstrakte ribosomene³⁵. Andre eksempler på oversettelseshemmere i bakterier er tetracyklin (TET)³⁶, retapamulin (RET)³⁴ og Onc112³⁷ som har blitt brukt til å undersøke oversettelsesinitieringssteder. TET, som forhindrer tRNA-levering til ribosomet ved å overlappe direkte med antikodonstammeløkken til tRNA på A-stedet, ble opprinnelig brukt for å verifisere resultatene oppnådd fra CAM-behandling siden de begge er antibiotika som hemmer oversettelsesforlengelse³⁸. TET ble funnet for å oppdage primær TIS, men kunne ikke avsløre intern TIS³⁶. RET binder seg i PTC av bakteriell ribosom, og forhindrer dannelse av den første peptidbindingen ved å forstyrre en langstrakt aminoacyl-tRNA på A-området. Bruk av RET resulterer i ribosomer arrestasjon på både primære og interne TISs³⁴. Onc112, et prolinrikt antimikrobielt peptid, binder seg i utgangstunnelen og blokkerer aminoacyl-tRNA-binding i ribosomal A-området. Som et resultat forhindrer Onc112 initieringskomplekser fra å komme inn i forlengelsesfasen³⁷.

Hovedinformasjonen ribosomeprofilering gir er ribosomer tetthet og deres posisjon på mRNA. Det ble brukt til å undersøke differensialgenuttrykk på oversettelsesnivå under ulike vekstforhold^1,6, måle translasjonell effektivitet^1,38,39 og oppdage oversettelsesreguleringshendelser som ribosomal pause¹⁰. RIBO-seq gjør det også mulig å avdekke oversettelsen av kommenterte ncRNA, pseudogenes og unannotated små åpne leserammer (ORF) som fører til identifisering av nye og / eller svært korte proteinkodingsgener^{10,12,22,30,37}. I slike tilfeller kan RIBO-seq finjustere og forbedre genommerknaden. Med sin høye følsomhet for identifisering av oversatte ORFer og dens kvantitative natur, kan ribosomprofilering også fungere som proxy for proteombestemmelsen eller i å hjelpe proteomikkstudier^31,34,39. Ved å kartlegge TIS avslører ribosomprofilering N-terminalt utvidede og avkortede isoformer av kjente proteiner^10,32. RIBO-seq ble også tilpasset for å studere samtidig translasjonell folding av proteiner^14,21,24. Denne metoden gjør det mulig å måle forlengelseshastigheter^1,10,39 eller dekodingshastigheter for individuelle codons⁶ og hjelper til med å utvikle kvantitative modeller av oversettelse¹⁷. Ribosomet profilering metoden er også i stand til å gi mekanistisk innsikt i ribosomet pause i bakterier^7,15,17, frameshifting⁴⁰, stop-codon readthrough²¹, terminering / resirkulering defekter^41,42 og ribosomal konformasjon endringer³³ i eukaryoter. RIBO-seq ble også tilpasset for å undersøke effekten av spesifikke transvirkende faktorer på oversettelse som miRNAs⁶ og RNA-bindende proteiner i eukaryoter^16,43. Det er imidlertid viktig å erkjenne at den eksperimentelle utformingen og den oppnådde oppløsningen av RIBO-seq bestemmer mengden informasjon som kan trekkes ut fra de resulterende sekvenseringsdataene¹².

Protocol

1. Eksempelsamling Forbered en bakteriekultur. Vi anbefaler et kulturvolum på 100 ml per prøve. Forbered utstyr og reagenser for prøvetaking: to scoopulas per prøve, sterile 0,45 μm blandede cellulose estere membran (MCE) filtre, 50 ml sterile rør, flytende nitrogen, 50 mg / ml kloramfenikol i 70% (vol / vol) etanol (valgfritt). Punkter lokket på 50 ml rør for å tillate flytende nitrogenfordampning og forhindre eksplosjon av lukkede rør. Dekontaminer scoopulas med laboratorievaskemiddel og 7…

Representative Results

De eksemplariske resultatene som presenteres her, ble oppnådd i en studie som undersøkte oversettelsesregulering i sporadiske WT Bacillus subtilis-celler. Nattkulturer ble fortynnet til OD600 lik 0,1 i 100 ml rikt medium og inkubert ved 37 °C med kraftig risting til OD600 nådde 0,5-0,6. Det rike mediet ble deretter erstattet med minimalt medium for å indusere sporuleringsprosessen, og inkubasjonen ble videreført i opptil fire timer. Celler ble høstet hver time som begynte med T0 – sp…

Discussion

Den viktigste tekniske utfordringen med ribosomet profilering er behovet for å raskt hemme oversettelse for å fange et øyeblikksbilde av ribosomer på mRNAer på en bestemt fysiologisk tilstand av interesse. For å oppnå dette brukes ofte oversettelseshemmere, rask høsting og blitsfrysing i flytende nitrogen. Påføring av antibiotika er valgfritt siden de kan forårsake artefakter. Kloramfenikol er et vanlig brukt stoff for å arrestere forlengelse av ribosomer i bakteriell RIBO-seq. Det forhindrer imidlertid ikke …

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0