Summary
Sfingolipider är bioaktiva metaboliter med väletablerade roller i mänsklig sjukdom. Karakteristiska förändringar i vävnader med masspektrometri kan avslöja roller i sjukdomsetiologi eller identifiera terapeutiska mål. OCT-föreningen som används för kryokonservering i biorepositorier stör emellertid masspektrometri. Vi beskriver metoder för att analysera sfingolipider i mänskliga vävnader inbäddade i OCT med LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sfingolipider är cellulära komponenter som har väletablerade roller i mänsklig metabolism och sjukdom. Masspektrometri kan användas för att avgöra om sfingolipider förändras i en sjukdom och undersöka om sfingolipider kan riktas kliniskt. Korrekt drivna prospektiva studier som förvärvar vävnader direkt från operationssviten kan dock vara tidskrävande och tekniskt, logistiskt och administrativt utmanande. Däremot kan retrospektiva studier dra nytta av kryokonserverade mänskliga prover som redan finns tillgängliga, vanligtvis i stort antal, vid vävnadsbiorepositorier. Andra fördelar med att skaffa vävnader från biorepositorier inkluderar tillgång till information associerad med vävnadsproverna inklusive histologi, patologi och i vissa fall kliniskpatologiska variabler, som alla kan användas för att undersöka korrelationer med lipidomikdata. Tekniska begränsningar relaterade till inkompatibiliteten hos optimal skärtemperaturförening (OCT) som används i kryokonservering och masspektrometri är emellertid en teknisk barriär för analys av lipider. Vi har dock tidigare visat att OCT lätt kan avlägsnas från humana biorepositorprover genom cykler av tvättar och centrifugering utan att ändra deras sfingolipidinnehåll. Vi har också tidigare konstaterat att sfingolipider i mänskliga vävnader kryokonserverade i OCT är stabila i upp till 16 år. I den här rapporten beskriver vi stegen och arbetsflödet för att analysera sfingolipider i humana vävnadsprover som är inbäddade i OCT, inklusive tvättvävnader, vägning av vävnader för datanormalisering, extraktion av lipider, beredning av prover för analys med vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS), masspektrometridataintegration, datanormalisering och dataanalys.
Introduction
Sfingolipider är bioaktiva metaboliter kända för sina roller i mänsklig metabolism och sjukdom 1,2. De reglerar komplexa cellulära processer såsom cellmigration, cellöverlevnad och död, cellrörelse, vesikulär handel, cellulär invasion och metastasering, angiogenes och produktion av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i regleringen av sfingolipidmetabolism bidrar till initiering och progression av cancer, bestämmer hur aggressiva cancerformer är och hur cancer svarar på och utvecklar resistens mot terapi 3,10. På grund av dessa breda effekter på sjukdomens etiologi är därför analysmetoder som exakt kan fastställa sjukdomsspecifika sfingolipidförändringar viktiga verktyg. Masspektrometri (MS) är den mest exakta och pålitliga metoden för att analysera sfingolipidförändringar.
Mänskliga prover som kan användas för analys av sfingolipidförändringar kan erhållas prospektivt från operationssviten eller retrospektivt från vävnadsbiorepositorier. Färska vävnader från kirurgi är fördelaktiga eftersom de kan analyseras direkt med MS eller andra analysmetoder. Att förvärva vävnader framåtriktat har dock administrativa, tekniska och logistiska hinder, och att samla in tillräckligt med prover för att nå statistisk kraft kan vara utmanande. Att erhålla vävnader från biorepositorier är fördelaktigt eftersom de kan förvärvas retrospektivt, i stort antal, och biorepositorier bekräftar histologi och patologi, använder standardrutiner för att kryogent bevara och lagra vävnader och kan tillhandahålla kliniskpatologiska data som kan användas för korrelationsanalyser. För att bevara molekylära och strukturella egenskaper kan biorepositorier dock kryokonservera vävnader genom att bädda in dem i optimal skärtemperatur (OCT) -förening, vilket vi har visat stör datanormaliseringsanalyser och kvantifieringen av sfingolipider genom vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har också visats att polyvinylalkohol och polyetylenglykol, de primära komponenterna i OCT-förening, resulterar i jonundertryckning i andra MS-analysplattformar12,13,14,15. Därför måste ULT-föreningen avlägsnas från vävnader före sfingolipidomisk analys av MS.
I en tidigare rapport har vi validerat ett protokoll för avlägsnande av ULT-förening från humana prover för LC-ESI-MS/MS-analys 11 och den metod som används för att väga vävnader för datanormalisering11. Här beskriver vi stegen i sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) och visar representativa data från humana lungadenokarcinomtumörer och normala intilliggande oengagerade vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avidentifierade mänskliga lungvävnader erhölls från Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under ett internt granskningsnämnd (IRB) godkänt protokoll (#HM2471). Användningen av möss för forskning och skörd av mössvävnader godkändes av VCU institutional animal care and use committee (IACUC).
1. Beredning av material
OBS: Dessa steg bör utföras en dag före vävnadstvätten.
- Förmärk och väg 1,5 ml polypropencentrifugrör med koncisa men tydliga identifieringskoder för varje prov som kommer att bearbetas nästa dag. Använd en kemiskt resistent permanent markör (se materialförteckning) som inte bleknar under den upprepade rörhanteringen.
- Öppna ett elektroniskt kalkylblad och märk på varandra följande kolumner med följande kolumnrubriker: röridentifierare (ID), rör ensam, rör w / vävnad och total vävnad. Ange röridentifierarna som ska bearbetas i kolumnen märkt rör-ID.
- Förkalibrera och nollställa en analytisk skala. Placera en ren 10 ml Erlenmeyerkolv i mitten av balansplattan (kolven fungerar som rörhållare). Stäng dörren till vägningskammaren och dra vågen åt med kolven.
- Väg 1,5 ml centrifugrör. Placera försiktigt röret i kolven och stäng vägningskammarens dörr. Låt vikten stabiliseras och registrera vikten i det kolonnmärkta röret ensamt.
OBS: Undvik att flytta 10 ml Erlenmeyerkolv vid vägning av rör. Om kolven flyttas, centrera kolven på nytt och ta bort balansen igen. Placera de stängda rören i ett ställ och förvara tills det behövs. - Förmärk 13 x 100 mm skruvglasrör och lock med identifieringskoderna och fyll dem med 2 ml metanol av LC-MS-kvalitet. Placera dem i ett rörställ, täck rören och förvara dem i kylskåp (4 °C) tills de används.
OBS: Använd en lösningsmedelsdispenser på flaska (se materialförteckning). Om en sådan inte är tillgänglig, använd glaspipetter för att undvika användning av plast vid dosering av organiska lösningsmedel. - Förmärk 13 x 100 mm glasprovrör. Täck och förvara provrören vid rumstemperatur.
- Förmärkta injektionsflaskor med autoinjektorer med identifieringskoder. Täck över och förvara injektionsflaskorna med autoinjektorer i rumstemperatur tills de används.
- Förbered vävnadstorkande vekar.
- Börja med att rengöra kirurgisk sax genom att nedsänka dem i LC-MS-metanol i 5 minuter och torka dem sedan med en ren vävnad av laboratoriekvalitet.
- Använd pulverfria handskar och snurra änden av en vävnad av laboratoriekvalitet (se materialtabell) tills en finsmalnande 30-40 mm veke bildas.
- Skär veken på den tjocka änden med metanolrenad sax. Lägg vekar i en ren kartong. Gör dubbelt så många vekar än vad som behövs för att bearbeta alla prover.
- Förbered förkortade 1 ml pipettspetsar. Använd metanolrengjord kirurgisk sax, skär 4-5 mm från spetsen på en 1 ml pipettspets och placera tillbaka spetsen i spetshållaren. Förbered dubbelt så många tips som prover som ska bearbetas.
OBS: Dessa kommer att användas vid hämtning av tvättade vävnader från rör. Rör inte vid slutet av spetsen. - Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före kylning av molekylärbiologisk kvalitet till 4 °C (0,5 L räcker). Detta kommer att användas för att hämta exemplar. För varje prov som ska bearbetas, förkyl (4 °C) 60 ml ultrarent avjoniserat vatten.
- Förbered masspektrometri interna standarder. Lös upp följande lipider i etanol:metanol:vatten (7:2:1; v/v/v) i en koncentration av 25 nmol/ml: d17:1-sfingosin, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol; D17:1-sfingosin-1-fosfat, heptadekasfin-4-enin-1-fosfat; C12-Ceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enin; C12-sfingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enin-1-fosfokolin; C12-glukosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glukosyl-sphing-4-eine; C12-laktosylceramid (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-laktosyl-sphing-4-en.
2. Tvätt av vävnad
OBS: Att slutföra alla steg i avsnitt 1 en dag tidigare gör det möjligt för en skicklig forskare att bearbeta upp till 40 prover per dag och nybörjare ~ 10-15 prover per dag. Börja tidigt på morgonen och sluta inte förrän alla steg i avsnitten 2.1-3.8 är klara.
- På den dag då vävnaderna kommer att behandlas, förbered arbetsområdet för biosäkerhetsskåpet genom att utrusta det med en virvel, en fulladdad serologisk pipett och en isbricka. För alla steg i detta avsnitt, använd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive en labbrock, ett dubbelt lager handskar och skyddsglasögon. VARNING: Mänskliga vävnader och vätskor bör betraktas och behandlas som biofarliga material.
- Förkyl (4 °C) en svängande skopcentrifug, alla adaptrar som behövs för att hålla 15 ml koniska centrifugrör och centrifugens bioinneslutningslock. Före kylning (4 °C) en centrifug med fast vinkel som kan hålla 1,5 ml centrifugrör.
- Om vävnader inte alikvoteras i 15 ml polypropencentrifugrör, använd en metanolrengjord spatel (ren för varje nytt vävnadsprov) för att överföra dem till förmärkta 15 ml polypropenrör. Märk 15 ml lock också.
- Placera ett rörställ som kan hålla 15 ml centrifugrör i en isbricka och fyll brickan med is. Tina vävnader som kommer att bearbetas den dagen genom att placera dem i stället på is.
OBS: Minst 3-4 mg vävnad bör begäras från biorepositoriet för bearbetning eftersom det tidigare har visats att vävnadstvätt- och vägningsprotokoll är korrekta och tillförlitliga vid dessa vikter11.
- Placera ett rörställ som kan hålla 15 ml centrifugrör i en isbricka och fyll brickan med is. Tina vävnader som kommer att bearbetas den dagen genom att placera dem i stället på is.
- Flytta isbrickan med proverna i biosäkerhetsskåpet.
- Utför tre sOCTrP-cykler11 som diskuteras nedan (dvs. utför steg 2.5.1-2.5.5 tre gånger).
- Tillsätt 10 ml iskallt ultrarent avjoniserat vatten till varje rör och täck dem tätt. Låt rören inkubera i 10 min.
- Virvla kraftigt varje rör i 10-20 s eller tills all vävnad som avsatts på rörets väggar, eller en vävnadspellet, är helt återupplivad.
OBS: I sOCTrP-cyklerna 2-3 är det viktigt att pelleten återsuspenderas så att eventuell OCT i pelleten späds ut i tvättlösningen. - Överför rören till den förkylda (4 °C) svängskopans centrifug. Centrifugera prover vid 4 000–5 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: Undvik generering av och exponering för biofarliga aerosoler som genereras under centrifugering genom att försegla centrifugbärarna med ett bioinneslutningslock (se materialförteckning). - Hämta prover från centrifugen och överför till isbrickan. Placera brickan i ett biosäkerhetsskåp och dra av rören. Spara kepsarna.
- Aspirera försiktigt tvättlösningen. Undvik att aspirera vävnadsmaterialet i pelleten genom att lämna ~ 0,5 ml av supernatanten i röret. Kapsla rören och undvik korskontaminering genom att matcha märkta lock med rör.
OBS: Tvättlösningen (supernatanten) i steg 2.5.5 är ett biologiskt farligt material. hantera och kassera det enligt riktlinjer för biosäkerhet som är lämpliga för exemplar av mänskligt ursprung.
3. Vävnadsvägning (för datanormalisering)
- Efter den sista sOCTrP-tvättcykeln, aspirera försiktigt det mesta av tvättlösningen men undvik att störa pelleten. Lämna ~ 0,5 ml av tvättlösningen i röret.
- Använd de förkortade pipettspetsarna (beredda i steg 1.9), ta upp 500 μL iskall PBS och tillsätt det i röret.
- Använd samma spets, återsuspendera försiktigt pelleten och hämta all vävnad. Undvik turbulent pipettering för att minska vävnadsförlusten genom dess vidhäftning till röret och pipettspetsväggarna.
- Tillsätt den återsuspenderade vävnaden till motsvarande förmärkta och förvägda 1,5 ml centrifugrör och placera röret på is. Upprepa för alla vävnader i datauppsättningen.
- Placera 1,5 ml rören i en förkyld centrifug och pelletera vävnaderna vid 7 000 x g i 5–7 minuter och 4 °C.
- Hämta rör och sug försiktigt in så mycket av PBS som möjligt utan att störa pelleten. Placera tillbaka röret på is.
- Centrifugrör i ytterligare 3 minuter vid 7 000 x g för att säkerställa att vävnaderna är väl pelleterade. Överför rören till is.
OBS: Det extra centrifugeringssteget är viktigt för att förhindra vävnadsförlust när du tar bort all tvättlösning och transporterar. Om du bearbetar mer än fem prover, upprepa centrifugeringssteget på 3 min, 7 000 x g efter att vart femte prov har bearbetats för att säkerställa att vävnaderna förblir pelleterade. - Använd vekarna som beretts i steg 1.8 och ta försiktigt bort eventuell återstående tvättlösning. Använd en ren veke för varje prov. Det är acceptabelt att försiktigt badda vävnaden med veken, vilket hjälper till att ta bort det mesta av tvättlösningen men undvika att förlora vävnad genom att fästa vid veken. Stäng röret och lägg det på is.
- Väg varje rör i den nyligen kalibrerade, tjärade och nollställda analysvågen.
- Placera varje rör i Erlenmeyerkolven i glas och stäng kammardörren. När vikten har stabiliserats, registrera den i den elektroniska kalkylbladskolumnen märkt rör w / vävnad.
- Efter vägning, placera röret tillbaka på is.
- Tillsätt 300 μl iskall PBS. Använd en förkortad pipettspets (steg 1.9), hämta försiktigt all vävnad och avlagringar i ett förmärkt skruvglasrör (förberett i steg 1.5) som innehåller 2 ml iskall metanol av LC-MS-kvalitet (tillsätt vävnaden till metanolen, inte till sidan av röret).
- Beräkna mängden vävnad som tvättades genom att subtrahera röret ensamt från rörets w / vävnadsvärde. Registrera detta nummer i den totala vävnadskolonnen. Det totala vävnadsvärdet kommer att användas för att normalisera masspektrometridata i steg 6.12.
- Förvara proverna vid -80 °C tills de är klara för att utföra steg 4.1–4.15.
OBS: Detta är en bra stopppunkt, och proverna kan förvaras säkert i ett par veckor vid -80 °C. För andra vävnadsnormaliseringsmetoder, såsom proteinkoncentration eller lipidfosfatinnehåll, se Rohrbach et al.11.
4. Lipid extraktion
OBS: Det är viktigt att börja dessa steg på morgonen, särskilt när många prover kommer att behandlas. Innan du börjar, förvärm ett vattenbad eller inkubator till 48 °C.
- Hämta de prover som beretts i steg 3.8 och MS-lipidstandarderna (framställda i steg 1.11) från frysen. Låt dem balansera till rumstemperatur i 20 minuter.
- Vortex och sänk ner den interna standardlösningen i ett ultraljudsvattenbad (se materialtabell) i 2-3 minuter eller tills MS-lipidstandarderna är helt upplösta innan de matas ut i prover. Detta undviker fel i datanormalisering.
- Tillsätt 250 pmol (10 μl från den 25 nmol/ml lösning som beretts i steg 1.11) av interna masspektrometristandarder med hjälp av en upprepande pipett till varje rör. Täck om rören lätt.
- För att underlätta homogenisering, justera metanolvolymen till 2 ml. Använd endast metanol av LC-MS/MS-KVALITET.
- Arbeta ett rör i taget, använd en homogenisator för att trituera vävnaden tills inga klumpar är synliga (vanligtvis 5-20 s). Flytta homogenisatorspetsen i en cirkulär rörelse och tryck försiktigt mot rörväggen för att underlätta triturering. Täck röret igen.
OBS: Att se till att alla vävnader är fintriturerade maximerar lipidutvinningen. Tillsätt inte kloroform i prover före homogenisering eftersom engångshomogenisatorspetsarna är gjorda av plast som löses upp i lösningar som innehåller kloroform. - Sänk ner röret i 45° vinkel i ett ultraljudsvattenbad i 5-10 s.
- Om inga vävnadsklumpar bildas vid nedsänkning i ultraljudsbadet, täck det och gå vidare till nästa rör.
- Om vävnadsklumpar bildas när röret är nedsänkt i ultraljudsbadet, återhomogenisera och rikta klumparna.
- Upprepa denna process (homogenisering/nedsänkning i ett ultraljudsbad) iterativt tills alla stora vävnadsklumpar bryts upp.
- I en rökhuv, tillsätt LC-MS-klass kloroform och metanol till varje rör (använd en flaskdispenser) för att uppnå ett förhållande på 2: 1: 0,1 metanol: kloroform: vatten. Försegla rören ordentligt med rena lock och låt stå på bänkskivan till slutet av dagen.
- För vävnader som väger 50 mg eller mindre, använd en total extraktionsvolym på 4 ml och justera med detta förhållande (50 mg:4 ml extraktionslösning) för större prover.
- Innan du lämnar kvällen, placera de tätt täckta rören i ett 48 ° C vattenbad eller inkubator och inkubera dem över natten.
OBS: Det är viktigt att rören är tätt täckta så att lösningsmedelsförhållandena inte förändras på grund av avdunstning. - Nästa morgon, hämta proverna från 48 °C vattenbad och pellet eventuellt lösningsmedelsolösligt skräp genom centrifugering vid 4 000–5 000 x g vid 4 °C i 20 minuter.
- Arbeta i en rökhuv, dekantera försiktigt supernatanten i de förmärkta 13 x 100 mm borosilikatglasprovrören. Luta 13 x 100 mm röret i 30-45° vinkel för att underlätta dekantering.
OBS: Om du bearbetar mer än 12 prover, låt inte de centrifugerade rören sitta under längre perioder eftersom pelletsen mjuknar och olösligt skräp kommer att överföras när steg 4.10 utförs. För att undvika detta, ta bara 12 rör ur centrifugen åt gången och fortsätt centrifugera de andra rören tills du är redo att dekantera dem. - Överför rören till en vakuumkoncentrator som kan hålla 13 x 100 mm rör. Indunsta allt lösningsmedel med ett initialt uppvärmningssteg på 1 timme (40 °C) och kör under maximalt vakuum.
- Ta bort rören från vakuumkoncentratorn och tillsätt 500 μL metanol av LC-MS-kvalitet (använd en flaskdispenser) till varje rör.
- Återsuspendera de torkade lipidextrakten genom att virvla i 5-10 s, följt av nedsänkning av rör i 45 ° vinkel i ett ultraljudsvattenbad i 2 minuter medan du roterar röret. Re-virvel i 5 s och fördjupa i ultraljud vattenbad i ytterligare en minut.
OBS: Detta är ett kritiskt steg för att säkerställa maximal återvinning av extraherade lipider. Gå inte framåt förrän allt torkat material på rörets vägg har återupplivats. - Placera rören på 13 x 100 mm i en förkyld centrifug (4 °C) och avlägsna olösligt skräp genom centrifugering vid 4 000–5 000 x g vid 4 °C i 20–30 minuter.
- Dekantera försiktigt den klarade supernatanten i en förmärkt injektionsflaska med autoinjektor. Att luta injektionsflaskan med autoinjektoren i en vinkel på 30-45 ° underlättar dekantering. Se till att hela innehållet i 13 x 100 mm-röret dekanteras i injektionsflaskan med autoloader.
- Täck rören ordentligt och förvara rören vid -80 °C tills de analyseras med LC-ESI-MS/MS.
5. LC-ESI-MS/MS-analys
OBS: Följande procedur använder ett binärt pumpsystem kopplat till en autoinjektor, avgasare och LC-MS / MS-system som arbetar i ett trippel-quadrupole-läge. Kolonntemperaturen bibehölls med hjälp av en pelarugn. Se materialförteckningen för mer information om den utrustning som används.
- Förbered mobil fas A1 (CH3OH: H2O: HCOOH, 58:41: 1, v: v: v, med 5 mM ammoniumformiat) och mobil fas B1 (CH3OH: HCOOH, 99: 1, v: v, med 5 mM ammoniumformiat). Använd endast lösningsmedel, vatten och reagenser av LC-MS-kvalitet.
- Bered för varje uppsättning prover fyra injektionsflaskor med blank autoloader som innehåller 500 μl metanol av LC-MS-kvalitet.
- För varje uppsättning prover bereds två injektionsflaskor med automatisk lastare enligt intern standard (märk som IS) genom utspädning av 10 μl (totalt 250 pmol varje standard) av den interna standardlösning som framställts i steg 1.11 i 500 μl metanol av LC-MS-kvalitet.
- Ställ in kolonnugnens temperatur på 60 °C och jonkällans temperatur på 500 °C.
- För MS/MS-analysen, använd spektrometerns trippel-quadrupole-läge. Ställ in den första fyrdubbla (Q1) för att passera prekursorjoner, medan du ställer in den tredje fyrdubbla (Q3) för att passera molekylärt distinkta produktjoner (eller en skanning över flera m / z i Q1 eller Q3) med hjälp av N2 för att kollisionsinducera dissociationer i quadrupole 2 (Q2), som är förskjuten från Q1 med 30-120 eV.
- Ställ in detekteringsfönstret för flera reaktionsövervakningspar (MRM) på 120 s med en målskanningstid på 1,0 s. Se tabell 1 för en lista över MRM-par, joniseringsenergier och kollisionsenergier.
- Använd följande parametrar för att lösa sfingolipider i LC-steget: använd en flödeshastighet på 0,7 ml/min, balansera en 2,1 (i.d) x 50 mm C18 omvänd faskolonn i 0,5 min med en lösningsmedelsblandning av 95% mobil fas A1 och 5% mobil fas B1.
- Efter provinjektion, behåll det mobila fas A1/B1-förhållandet vid 95/5 i 2,25 min, följt av en linjär gradient till 100% B1 under 1,5 min, som sedan hålls vid 100% B1 i 5,5 min, följt av en 0,5 min gradientåtergång till 95/5 A1/B1.
- Efter körningen, balansera kolonnen igen med en blandning av 95/5 A1/B1 i 0,5 min.
- Använd följande inställningar för exempelautoladdaren: sköljvolym, 500 μL; nålslag, 52 mm (detta bör justeras beroende på injektionsflaskans storlek och volym i varje injektionsflaska); sköljhastighet, 35 μl/s; Provtagningshastighet, 5,0 μl/s. skölj dopptid, 2 s; sköljläge, före och efter aspiration; sköljtid,2 s.
- Placera prover som beretts i steg 4.15 på ett autoloader-fack i följande ordning: Tom; VARA; Blank; Prover som beretts i steg 4.15. Tom, ÄR, Tom.
- Analysera 5–10 μL av varje prov med LC-ESI-MS/MS. Analysera samma volym för alla prover i datauppsättningen.
6. Databehandling, integration och normalisering
OBS: Även om följande steg beskriver en procedur för specifik programvara (se materialförteckning), kan liknande procedurer på motsvarande LC-MS-instrument och programvara användas för att integrera MRM-par för de analyserade lipidklasserna och motsvarande interna standarder.
- Öppna kvantifieringsprogramvaran. På fliken Kvantifiera dubbelklickar du på kvantifieringsguiden. I popup-fönstret, i den vänstra arbetsytan, navigerar du till rätt datauppsättning och vänsterklickar på den. De tillgängliga exemplen visas i den mellersta arbetsytan.
- Markera de prover som ska analyseras och klicka sedan på högerpilen för att lägga till exempel i arbetsytan Valda exempel . Klicka på Nästa för att navigera till inställnings- och frågeskärmen där standardinställningarna vanligtvis används.
- Träffa Nästa för att navigera till skärmen för val av integrationsmetod. Välj en lämplig integrationsmetod som innehåller MRM-övergångspar för lipider som ska analyseras. Se tabell 1 för MRM-övergångspar. Tryck på Finish.
Kvarhållningstiderna varierar beroende på instrumentation och enskilda inställningar och måste därför verifieras för varje enskild installation. - I navigeringsfältet klickar du på fönstret Peak Review så att MRM-par kan inspekteras. För att underlätta granskningen högerklickar du på fönstret Peak Review , ändrar automatisk zoomning till 100% av den största toppen och ett zoomfönster på 1,00 - 2,00 minuter.
- Högerklicka på fönstret Quantitation Display och välj Analyte och önskad sfingolipid som ska undersökas. Kontrollera att det inte finns några toppar i blankproverna och att rätt topp har integrerats i IS-proverna.
- Börja integrera okända exempel. Arbeta en sfingolipidklass i taget, inspektera retentionstiden för MRM-paret i den interna standarden (dvs. C12: 0 ceramid) och se till att programvaran har integrerat rätt topp.
- Fortsätt till analyterna i samma lipidklass (dvs. C14:0 ceramid, C16:0-ceramid, etc.), som börjar med den kortaste kedjelängdslipiden i klassen. Kontrollera för varje kedjelängd lipid att programvarurutinen har integrerat rätt MRM-partopp.
- När alla analyter har integrerats, skapa ett elektroniskt kalkylblad för varje sfingolipidart som analyseras (t.ex. ceramider, sfingomyeliner, etc.). Etikettkolumnrubriker som matchar ordningen på analyterna och kedjelängderna i LC-MS/MS-kvantifieringsprogrammet. Inkludera även en kolumnrubrik för prov-ID och provnormaliseringsvikter som bestämdes i steg 3.9.
OBS: Som tidigare beskrivits11 inkluderar andra vanliga normaliseringsåtgärder totalt lipidfosfatinnehåll eller proteinmängd. - Exportera eller kopiera toppområdena för alla analyter och interna standarder till det elektroniska kalkylbladet.
- Normalisera data genom att dividera det integrerade toppområdet för varje kedjelängdsart för en given sfingolipidklass med topparean för dess motsvarande interna standard. Till exempel C14: 0 ceramid, C16:0 ceramid, C18:1 ceramid, etc., ska var och en delas med C12:0 ceramid intern standard topparea.
- Konvertera topparean till mol lipid som återvunnits genom att multiplicera den normaliserade topparean (beräknad i steg 6.10) med mängden intern standard, i picomoles, som tillsattes provet i steg 4.3. I detta protokoll är denna mängd 250 pmol.
- För att erhålla den relativa mängden lipid i varje prov, dela picomolerna för varje lipidkedjelängd med den vävnadsvikt som bestäms i steg 3.9. Detta kommer att ge enheter av picomoles av lipid per mg vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi i detalj en metod för att avlägsna OCT från kryokonserverade mänskliga vävnader och väga vävnaderna för analys av LC-ESI-MS/MS. De material som krävs för denna procedur listas i materialförteckningen. I figur 1 visas resultat av ett typiskt experiment där 10 humana lungadenokarcinomtumörer och 10 normala intilliggande vävnader tvättades för att avlägsna OCT och analyserades av LC-ESI-MS / MS. Viktigt, som vi tidigare har visat11, finns det olika kedjelängdsarter av ceramider (Figur 1A) och monohexosyl-ceramider (Figur 1B) som är signifikant förhöjda i lungadenokarcinomtumörer jämfört med normala intilliggande oengagerade vävnader.
I kontrollexperiment för att bedöma effekten av OCT på lipidextraktionsstegen som beskrivs i avsnitt 4 återsuspenderades 200 mg mösslever (C57BL6; män; 14-16 veckor gamla) i 2 ml fosfatbuffrad saltlösning och homogeniserades tills de fintriturerades. Den resulterande fina leversuspensionen var sedan omfattande sonicated med en sond sonicator (tre omgångar av 1 min ultraljudsbehandling på is, 1 min vila på is, 60% kraft; mikrotip). Från denna lösning framställdes sex 300 μL leverhomogenatreplikat. Till tre replikat tillsattes 200 mg OCT (genomsnittlig mängd hittades i biorepositoritärprover11) och 200 μl vatten tillsattes till de andra tre. Proverna behandlades sedan parallellt enligt de steg som beskrivs i avsnitt 4. Viktigt är att efter centrifugering av enfas Bligh-Dryer-lösningen var prover som innehöll OCT grumliga medan kontrollproverna som innehöll vatten var klara (figur 2A). Molnigheten i enfas lipid extraktion lösning kvarstod även efter ökad centrifugering och omfattande ultraljudsbehandling (visas inte). Efter att lösningsmedlet avdunstat hade prover innehållande OCT stora pellets (figur 2B), som inte kunde rekonstitueras i metanol även under kraftig virvelbildning och omfattande ultraljudsbehandling. Prover som innehöll OCT visade också en stor signalförlust för interna standarder för alla analyserade arter (figur 3A-G). Vi har också tidigare visat att prover innehållande OCT visade signalförlust för många av de sfingolipider som analyserades11.
Vanligtvis förväntas det att sfingolipidstandarderna kommer att eluera sekventiellt som visas i figur 4 i följande ordning: d17:1 sfingosin, d17:1 sfingosin-1-fosfat, C12:0 laktosyl-ceramid, C12:0 monohexosyl-ceramid, C12:0 sfingomyelin och C12:0 ceramid. För var och en av dessa sfingolipidarter, med hjälp av gradient- och instrumentinställningarna som beskrivs i avsnitt 5 och tidigare 11, kommer det att finnas ungefär en +0,15 minuters förskjutning i retentionstiden för varje 2-kolökning i kedjelängd. Till exempel, som visas i figur 5, kommer C14: 0-ceramid (figur 5B) att eluera ungefär +0,15 minuter senare än C12: 0-ceramid (figur 5A). En dubbelbindning i fettsyran resulterar ofta i en -0,15 förskjutning av retentionstiden, så C16:0-ceramid (figur 5C) kommer att ha en retentionstid som liknar C18:1-ceramid (figur 5D). Lipider med längre kedjelängd (dvs. C24:0, C26:0) kan dock ha större retentionstidsförskjutningar (figur 5I,K).
Figur 1: Sfingolipidprofiler av lungadenokarcinom och intilliggande oengagerade lungvävnader. Vävnader lagrades kryogent i OCT, tinades, bearbetades med tre sOCTrP-cykler, vägdes och analyserades av LC-ESI-MS / MS. Nivåerna är i pmol per mg vävnad. De angivna acylkedjelängdarterna av ceramid (A), monohexosylceramid (B), sfingomyelin (C), laktosylceramid (D) och sfingosin (E; Sph), sfingosin-1-fopshate (F; S1P), dihydro-Sph (E) och dihydro-S1P (F) kvantifierades. n = 10 tumörer och n = 10 intilliggande oengagerade vävnader. Rutdiagram visar medianer (svart linje) och morrhår på min till max ns, inte signifikanta; , s≤0,005; , s ≤ 0,0005. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av extraherade prover med och utan ULT. Muslever homogeniserades och sonikerades, delades upp i sex identiska prover: 200 mg OCT tillsattes till tre prover och vatten till de andra tre. (A) Efter att metanol och kloroform tillsatts för att uppnå ett förhållande på 2:1:0,1 metanol:kloroform:vatten (v:v:v), inkubation över natten vid 48 °C, följt av centrifugering, var supernatanterna i prover som innehöll OCT grumliga och kunde inte klarläggas genom ultraljudsbehandling, virvel eller centrifugering. (B) Efter avdunstning av lösningsmedel återvanns en stor pellet från prover innehållande ULT som inte kunde rekonstitueras helt i 0,5 ml metanol efter omfattande ultraljudsbehandling och virvelbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: LC-ESI-MS/MS-kvantifiering av sfingolipidstandarder i närvaro eller frånvaro av ULT. Muslever homogeniserades, sonikerades och delades upp i sex identiska prover. Till tre av de sex proverna tillsattes 200 mg ULT, medan vatten tillsattes till de övriga tre. Efter tillsats av interna standarder, metanol och kloroform bearbetades prover identiskt och extraherade lipider analyserades av LC-ESI-MS / MS. Visas är flera reaktionsövervakningspar (MRM) av de angivna lipiderna (A-F) och motsvarande integrerade toppområden (G). Förkortningar: Sph, sfingosin; S1P, sfingosin-1-fosfat. Svarta pilar pekar på rätt MRM-par för den angivna sfingolipiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Relativa retentionstider för LC-ESI-MS/MS multipla reaktionsövervakningspar av sfingolipidstandarder. Muslever homogeniserades och sonikerade; interna standarder, tillsatt metanol och kloroform; och lipider extraherade och analyserade av LC-ESI-MS / MS. Visas är retentionstider för flera reaktionsövervakningspar av de angivna lipiderna (A-F). Observera den relativa ordningen i vilken lipider eluerar under vätskekromatografigradienten. Förkortningar: Sph, sfingosin; S1P, sfingosin-1-fosfat; SM, sfingomyelin. X-axeln är MRM-parhållningstid i minuter. Y-axeln är signalintensitet för MRM-paren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Acyl-kedjelängdsberoende förskjutning i retentionstiden för LC-ESI-MS/MS MRM-par. Muslever homogeniserades och sonikerade; interna standarder, tillsatt metanol och kloroform; och lipider extraherade och analyserade av LC-ESI-MS / MS. Visas är retentionstider och MRM-par av de angivna lipiderna. Observera förskjutningen i retentionstid med ökande acylkedjelängd för olika lipider (A-K), vilket vanligtvis motsvarar en +0.15 min retentionstid per 2-kolökning. En dubbelbindning kommer att resultera i en -0,15 minuters retentionstidsförskjutning (D,H,J). Men för längre kedjelipider kan den relativa ökningen av retentionstiden vara längre (G-K). X-axeln är MRM-parhållningstid i minuter. Y-axeln är signalintensitet för MRM-paren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: MRM-par, joniseringsparametrar och kollisionsenergier för LC-ESI-MS/MS-analys. DP, avklusterpotential; CE, kollisionsenergi. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT är ett vanligt långsiktigt kryokonserveringsmedel som används i biorepositorier. OCT kan dock resultera i jonundertryckning när vävnader analyseras av olika masspektrometriplattformar12,13,14,15, eller resultera i signalförlust när prover analyseras av LC-ESI-MS/MS 11. OCT i kryokonserverade vävnader kan också störa vävnadsnormaliseringsmetoder som vägnings- och proteinkvantifieringsanalyser som Bradford och BCA11. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att ta bort OCT från mänskliga vävnader och därefter analyseras med masspektrometri. Protokollet kan modifieras för att använda andra vävnadskällor som inte är lungor eller från mössvävnader som vi tidigare har beskrivit11. Dessutom kan andra masspektrometridatanormaliseringsstrategier användas, inklusive de som vi tidigare har beskrivit11, liksom andra validerade metoder.
En viktig begränsning av detta protokoll är att det inte är tillräckligt för analys av vävnader som tidigare har fixerats med formaldehyd eller annat fixeringsmedel. Det är endast lämpligt för vävnader som inte har åtgärdats och som har kryokonserverats i ULT. Dessutom är denna metod inte tillräcklig för bearbetning av vävnader som väger mindre än 1-2 mg eftersom det alltid finns en viss vävnadsförlust under sOCTrP-stegen och överföringar mellan rören. Det kommer att vara svårt att väga sådana små vävnader med hjälp av en standardanalytisk skala, och eventuell kvarvarande PBS som inte tas bort under transportstadiet kommer att bidra mycket till det experimentella felet. Nedan följer andra viktiga överväganden när du tvättar vävnader för att ta bort OCT med denna metod.
För att säkerställa ett smidigt genomförande av detta protokoll, särskilt om många prover kommer att bearbetas, bör steg som beskrivs i avsnitt 1 utföras i förväg, inklusive förmärkning och förvägning av 1,5 ml rör, förmärkning av 13 x 100 mm skruvlocksrör och lock, 13 x 100 mm odlingsrör och injektionsflaskor med autoinjektor, beredning av alla vekar, förförkortning av 1 ml pipettspetsar, och förkylande tvättlösningar. Detta förhindrar att tidskrävande procedurer måste utföras den dag då vävnader tvättas, vilket kan leda till förseningar. I allmänhet finner vi att om många av dessa steg utförs dagen innan kan en erfaren forskare tvätta 30-40 exemplar under en normal arbetsdag. Men eftersom den första föreslagna stopppunkten är efter att alla vävnader har tvättats, vägts och placerats i metanol och lagrats vid -80 ° C, kommer det att påverka effektiviteten och förlänga den tid som krävs för att tvätta 30-40 vävnader om du inte utför 1,5 ml förvägning och märkning i förväg.
Vävnadsvägning är ett av de viktigaste stegen, eftersom fel eller slarv kommer att påverka datakvaliteten eftersom de kommer att överföras till datanormalisering. Det är viktigt att analysvågen som används för vägning kalibreras, nollställs och tjäras ordentligt. Följaktligen är det viktigt att ta bort så mycket av tvättlösningen som möjligt när du använder vekar, särskilt för vävnader som väger mindre än 5 mg. Vid dessa vävnadsvikter kommer kvarvarande tvättlösning att göra vägningen felaktig med en stor procentandel och överföras som ett fel i datanormalisering. När vi tar bort tvättlösningen finner vi att vävnader försiktigt kan vidröras med veken i flera sekunder för att ta bort så mycket tvättlösning som möjligt utan att leda till betydande förluster av vävnad genom vidhäftning till veken. Varje vävnadstyp som tvättas bör dock testas för vidhäftning till vekar, och dessa steg i protokollet justeras i enlighet därmed.
För att underlätta arbetsflödet för vävnadstvätt rekommenderas att vävnadsspån begärs från biorepositoriet i 15 ml polypropenrör. Detta kommer att minska hanteringen av vävnader före tvätt.
Vid tvättning av vävnader, om ett gelliknande material observeras i botten av ett rör efter den tredje sOCTrP-cykeln, är detta ett tecken på att inte alla OCT har tagits bort och fler sOCTrP-cykler behövs. Håll reda på hur många cykler som behövs och utför samma antal sOCTrP-cykler i alla prover i datauppsättningen för konsekvens. Vi har tidigare utvärderat upp till 9 sOCTrP-cykler och fann ingen effekt på utarmning av sfingolipider i vävnader11.
När du använder vekar för att ta bort tvättlösningen, kommer försiktigt dabbing av vävnaden att säkerställa att all tvättlösning tas bort. Detta ökar noggrannheten i vävnadsviktuppskattningen. Stor försiktighet måste dock iakttas med mycket små vävnader eftersom dessa kan fastna på veken och resultera i förlust av prov. Det är bra att använda flera vekar för samma rör för att ta bort så mycket lösning som möjligt. För att förhindra kontaminering av korsprov, använd alltid en ny och ren veke för varje prov. När du tillverkar vekar, använd vävnad av laboratoriekvalitet (se materialtabell) eftersom vi tidigare testat dessa och funnit innehålla en försumbar mängd förorenande sfingolipider11. Vekar från andra material kan användas om de testas enligt beskrivningen11.
Vid hämtning av prover från 1,5 ml rör efter vägning är det viktigt att all vävnad återvinns. Om du inte gör det kommer det att leda till fel i datanormaliseringen. Om mer PBS behövs för att återvinna all vävnad, lägg till motsvarande mängd PBS som används i alla andra rör för att undvika skillnader i extraktionseffektivitet som kan uppstå från prover som innehåller olika mängder PBS. Justera kloroform- och metanolvolymerna för att ta hänsyn till eventuella ökningar av vattenvolymen för att upprätthålla ett förhållande på 2:1:0,1 metanol:kloroform:vatten.
Vid upptining av prover är det viktigt att detta steg görs på is för att undvika nedbrytning av labila lipider såsom sfingosin-1-fosfat. Att helt tina proverna tills OCT är i flytande tillstånd kommer också att underlätta avlägsnandet eftersom det lättare kommer att lösas upp i kalltvättlösningen snarare än att förbli som en pellet under tidiga tvättsteg.
Ibland, särskilt vid tvätt av lungvävnader, kommer det att finnas fragment som inte kommer att pellet och kommer att flyta ovanpå tvättlösningen efter centrifugering. Med försiktighet kan nedsänkning av aspireringsspetsen under de flytande vävnaderna för att ta bort tvättlösningen förhindra förlust under aspiration.
Tillsätt inte kloroform till prover före homogenisering eftersom engångshomogenisatorspetsarna är gjorda av plast och löses upp i lösningar som innehåller kloroform. Detta kan avsevärt påverka LC-MS/MS-kvantifieringen av lipider i proverna. Därför bör i allmänhet användning av plast som inte är resistenta mot lösningsmedel undvikas vid dosering av kloroform och metanol. Dessa lösningsmedel är också giftiga och bör hanteras i en lämplig dragskåp. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av lösningsmedel som metanol och kloroform.
Mänskliga vävnader bör bearbetas i ett lämpligt biosäkerhetsskåp (t.ex. klass II). Användare bör utbildas i hantering av biofarliga material och vätskor av mänskligt ursprung och följa säkerhetsprotokoll som att bära lämplig personlig skyddsutrustning och dekontaminera alla ytor eller utrustning som kommer i kontakt med prover. Användare bör desinficera (se materialförteckningen för föreslagen dekontaminant) alla ytor eller utrustning (centrifuger, centrifugbärare och adaptrar, pipetter, virvel, dragskåpsytor, balanser, glas, isbrickor, datortangentbord, datormus etc.) som används under tvättproceduren. Labbmedlemmar ska inte använda utrustning eller huvar som används för vävnadstvätt förrän de har desinficerats ordentligt. Undvik användning av blekmedel på stålytor och elektronik.
Vid bearbetning av många prover, var försiktig för att förhindra korskontaminering med rena lock i omkapslingssteg under lipidextraktionsstegen. Kepsar kan också återanvändas om de är märkta. I praktiken finner vi dock att markörer sticker ut dåligt på de svarta locken, och självhäftande etiketter faller av rören under nattens 48 °C inkubation.
Sfingolipider har visat sig vara viktiga aktörer i etiologin för sjukdomar och mänskliga cancerformer. Därför finns det stort intresse för att exakt definiera sfingolipidmetabolismförändringarna i dessa sjukdomar eftersom de kan avslöja terapeutiska mål. Många av de vävnader som är lättillgängliga för forskare är dock kryokonserverade i OCT, vilket inte är kompatibelt med masspektrometrianalys. Således kommer det detaljerade protokollet som beskrivs här att utöka repertoaren av vävnader som är tillräckliga för kvantitativ sfingolipidomisk analys och därmed bidra till att öka vår förståelse för biologin för lipidmetabolismförändringar i mänsklig sjukdom och cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Tjänster och stöd för forskningsprojektet tillhandahölls av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core och VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som delvis stöds med finansiering från NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13x100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13x100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 581300-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13x100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S.
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J.
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
