העמסת חרוזים מכניסה חלבונים, פלסמידים וחלקיקים לתאי יונקים חסידים. טכניקת טעינת תאים זו זולה, מהירה ואינה משפיעה באופן מהותי על תקינות התא. הוא מתאים ביותר להדמיה של תאים חיים.
ניסויים רבים בהדמיה של תאים חיים משתמשים בחלקיקים אקסוגניים (למשל, פפטידים, נוגדנים, חרוזים) כדי לתייג או לתפקד בתוך התאים. עם זאת, החדרת חלבונים לתוך תא על פני הממברנה שלה קשה. הבחירה המוגבלת של השיטות הנוכחיות נאבקת ביעילות נמוכה, דורשת ציוד יקר ותובעני מבחינה טכנית, או פונקציות בתוך פרמטרים צרים. כאן, אנו מתארים טכניקה פשוטה וחסכונית יחסית לטעינת דנ”א, רנ”א וחלבונים לתאים אנושיים חיים. העמסת חרוזים מאפשרת הפרעה מכנית זמנית לקרום התא, ומאפשרת למקרומולקולים להיכנס לתאי יונקים חיים ודבקים. בפחות מ-0.01 דולר לניסוי, טעינת חרוזים היא שיטת טעינת התאים הזולה ביותר הזמינה. יתר על כן, טעינת חרוזים אינה מלחיצה תאים באופן משמעותי או משפיעה על הכדאיות או ההתפשטות שלהם. כתב יד זה מתאר את השלבים של הליך טעינת החרוזים, ההתאמות, הווריאציות והמגבלות הטכניות. מתודולוגיה זו מתאימה במיוחד להדמיית תאים חיים אך מספקת פתרון מעשי ליישומים אחרים הדורשים הכנסת חלבונים, חרוזים, RNA או פלסמידים לתאי יונקים חיים ודבקים.
טעינת מקרומולקולים לתאי יונקים מחייבת מתודולוגיה המאפשרת להם לחצות את קרום הפלזמה של התא1. מספר שיטות יכולות להכניס פלסמידים לתאי יונקים באמצעות טרנספקטציה, כולל טרנספקטציה ליפוזומית2 והעברת דיתילאמינואתיל-דקסטרן3. עם זאת, שיטות לטעינת חלבונים או חלקיקים אטומים לממברנה לתאים מוגבלות יותר.
מספר טכניקות עקפו את המשוכה הקשה הזו באמצעות אסטרטגיות שונות. ראשית, מיקרו-נסיגה מעבירה חלקיקים דרך מיקרופיט לתאים חיים תחת מיקרוסקופ4. אמנם ניתן לטעון את השיטה הנשלטת ביותר ופחות פולשנית, טכניקה זו היא תפוקה נמוכה יחסית כי תאים חייבים להיות טעונים אחד אחד. יתר על כן, microinjection דורש ציוד מיוחד והוא תובעני מבחינה טכנית.
שנית, אלקטרופורציה היא דרך להזריק חלבונים אלקטרו לתאים באמצעות הפרעה ממברנה הנגרמת מתח5,6,7. עם זאת, שיטה זו שוב דורשת ציוד מיוחד ויקר, וההלם יכול לגרום ללחץ תאים ותמותה. יתר על כן, תאים חייבים להיות טריפסינציה לפני electroporation ולאחר מכן נשתל, הגבלת מסגרת הזמן שבה תאים ניתן לחקור לאחר אלקטרופורציה.
שלישית, קרום התא עשוי להשתנות כימית עבור זמני, הפיך permeabilization8,9. טעינת סטרפטוליסין-O מכניסה אנדוטוקסין לקרומי התא, היוצר נקבוביות זמניות, ומאפשרת לחלקיקים אקסוגניים אטומים לקרום, כולל חלבונים ופלסטיות DNA, להיכנס לתאים10. לאחר התאוששות של 2 שעות, כמחצית מהתאים מתקנים את הנקבוביות האלה ומפסיקים את הפנמת החלקיקים מהפתרון. עם זאת, טכניקה זו דורשת זמן התאוששות ארוך והוא אינו עולה בקנה אחד עם סוגי תאים שאינם יכולים לסבול אנדוטוקסינים.
רביעית, הפרעה מכנית מעמיסה חלקיקים לתאים באמצעות הפרעה פיזית של קרום התא11. זה יכול להיעשות בדרכים מרובות, כולל גירוד, גירוד, וחרוזים מתגלגלים על גבי תאים12,13. כבר בשנת 1987, חרוזים שימשו לטעינת חלבונים לתאיםמכנית 14. לאחרונה, טכניקת טעינת החרוזים עברה אופטימיזציה והותאמה מעבר לחלבונים כדי לכלול טעינה של פלסמידים ורנ”א, כמתואר כאן.
העמסת חרוזים היא שיטה קלה, זולה ומהירה לטעינת חלבונים ופלסטידים לתאים אנושיים חסידים. חרוזי זכוכית מגולגלים לזמן קצר על גבי תאים, ומשבשים באופן זמני את הממברנה התאית שלהם. זה מאפשר לחלקיקים בתמיסה להיכנס. כמו טעינת חרוזים יש יעילות נמוכה, זה מתאים ביותר עבור מולקולה אחת או ניסויים מיקרוסקופיה של תא יחיד. העמסת חרוזים יכולה להכניס מגוון רחב של חלבונים, כולל נוגדנים מקוטעים (Fab),15,16 חלבונים מטוהרים כמו scFvs,17 inbodies,18,19, או חלבוני מעיל mRNA, למשל, חלבון שכבת MS2 (MCP)20,21. ניתן להוסיף וקטורים לביטוי פלסמיד גם לתמיסת החלבון ולהעמיס חרוזים בו זמנית22,23,24,25.
מעבר לחלבונים ולפלסמידים, מולקולות גדולות כמו 250 ננומטר חרוזי פוליסטירן הוכנסו לתאים באמצעות טעינת חרוזים (תקשורת אישית). טעינת חרוזים זולה להפליא, עולה פחות מ-0.01 דולר לניסוי בחומרים ולא דורשת ציוד יקר נוסף. העלות מופחתת עוד יותר על ידי מזעור כמות הבדיקות המשמשות לניסוי מכיוון שרק התאים במיקרווול המרכזי בקוטר 14 מ”מ של תא הדמיה נטענים. יש לציין כי אזור הטעינה המוגבל פירושו כי טעינת חרוזים אינה אידיאלית עבור טעינת תא בצובר.
כתב יד זה מציג את תהליך טעינת החרוזים, כולל כיצד לבנות את מנגנון טעינת החרוזים ולבצע ניסוי. הוא מראה כי חלבונים, RNA ו- DNA יכולים להיות נטענים לסוגי תאים שונים וכי שני חלבונים שונים, בו זמנית טעונים חרוזים יש ריכוזי תאים מתואמים מאוד ושונות נמוכה יחסית. כמו כן נדונים וריאציות בפרוטוקול המבוססות על סוג התא וטעינת חלבון, פלסמיד או RNA. למרות חרוזים נחשבים לנקב ולשבש את קרום התא, בעת ביצוע כראוי, תהליך טעינת חרוזים פורק רק מספר קטן של תאים מתחתית תא ההדמיה. לאחר תקופת התאוששות קצרה, התאים ממשיכים לגדול ולהתחלק. מתודולוגיה זו אידיאלית לניסויים במיקרוסקופיה של תאים חיים, כולל מעקב אחר חלבון חד-מולקולה ורנ”א, זיהוי שינויים לאחר תרגום, התבוננות במנגנונים תאיים דינמיים, או ניטור לוקליזציה תת-תאית15,16,22,26,27.
טכניקת טעינת החרוזים המתוארת כאן היא שיטה חסכונית וחסכונית בזמן להכנסת מקרומולקולים וחלקיקים אחרים לתאים דבקים. תהליך רב-תכליתי זה יכול לטעון חלבון (איור 2A)15,16,26,27, שילוב של חלבון ו plasmids ( איור2B,C)22,25, RNA ( איור4C), 100 ו 250 ננומטר חרוזים פוליסטירן (התכתבות אישית), צבעים סינתטיים39 או נקודות קוונטיות34,40 . טעינת חרוזים עשויה להיות היכולת לטעון סוגים אחרים של חלקיקים בלתי חדירים ממברנה גם כן. היישום הנפוץ ביותר שלה הוא לטעינת נוגדנים או Fabs כדי למקד אפיטופים אנדוגניים, כגון שינויים לאחר תרגום (PTMs), לתאים חיים. מטרות, כגון PTMs, לעתים קרובות קשה לתייג בתאים חיים ללא מבוסס PTM ספציפי, גנטית מקודד בדיקות41,42. לעומת זאת, טעינת חרוזים יכולה להכניס סוגים מרובים של בדיקות, כתבים או כלים מולקולריים אחרים יחד לאותו תא לניטור קריאות מרובות בו זמנית. אנו צופים כי טעינת חרוזים תהיה טכניקה שימושית לטעינת מגוון של macromolecules או חלקיקים.
יתרון מרכזי של טעינת חרוזים הוא העלות הנמוכה: כל ניסוי עולה פחות מ 0.01 USD. ניתן נעשה בקלות באמצעות חומרים זולים שעולים בסך הכל ~ $ 150, וזה פחות יקר באופן משמעותי מכל שיטת טעינת תאים אחרת. ניתן להפחית עוד יותר את עלותו של מנגנון מטעין חרוזים אל מתחת ל-10 דולר על ידי החלפת תא המתכת לשימוש חוזר בתא פלסטיק. בשביל זה, או לקדוח חור בתא 35 מ”מ או להסיר את הזכוכית מתא זכוכית 35 מ”מ תחתון, ולאחר מכן להדק את הרשת במקום עם סרט. במקום מנגנון, טעינת חרוזים יכולה אפילו להתבצע באמצעות קצה פיפטה רחב נשא 1000 μL כדי לסקופ ומפזרים חרוזים על תאים, אם כי וריאציה זו מקשה על מפזרים monolayer של חרוזים על תאים (שלב 4.6).
יתרון נוסף של טעינת חרוזים הוא שהתאים יכולים לשמור על מורפולוגיה כללית נורמלית, להתאושש במהירות ולהמשיך לגדול ולחלק, לפחות עבור תאי U2OS, RPE1 ו- HeLa שנחקרו כאן ולקווי התאים האחרים שנחקרו במקומות אחרים (איור 3; איור 4א,ב’; וידאו משלים 1; ושולחן 1)31. במהלך טעינת חרוזים, תאים עוברים לחץ פיזי ולפעמים מחלצים ומתקלפים (כ -5% מהתאים מתקלפים בתנאים אופטימליים, אך אובדן תאים גדול יותר יכול לקרות אם טעינת חרוזים מבוצעת בעוצמה רבה מדי או יותר מדי חרוזי זכוכית נטענים על גבי התאים, כפי שמתואר באיור 3B). עם זאת, תאים עמוסי חרוזים שנותרו מחוברים לכיסוי נראים בדרך כלל בריאים וניתן לדמיין אותם כבר 30 דקות לאחר טעינת חרוזים (איור 3A). בדרך כלל אנו מאפשרים לתאים תקופת התאוששות של 30 דקות, אך צופים כי הדמיה מוקדמת יותר לאחר טעינת חרוזים היא אפשרית.
החיסרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים צריכים להיות מסוגלים לעמוד בלחץ פיזי קל במהלך הטעינה ולהישאר דבקים בבטחה בכיסוי. קווי תאים או תאים לא דבקים/לא דבקים הגדלים על לוחות מצופים (למשל, HEK ותאי גזע) מתנתקים לעתים קרובות בעת הקשה עדינה במהלך טעינת חרוזים. יתר על כן, הניסיון הראה כי נוירונים ראשוניים רגישים מדי עבור טעינת חרוזים.
טעינת חרוזים מתאימה ביותר לניסויים חד-תאיים או חד-תאיים. מניסיוננו, טעינת חרוזים יש בערך 20-40% יעילות טעינת חלבון, ~ 20% של תאים חרוזים גם ביטא plasmid טעון במשותף (איור 2A,B). לכן, פלסמידים טעינת חרוזים עשוי להיות פחות יעיל עבור ביטוי חלבון מאשר חרוז טעינת חלבונים מטוהרים כי plasmids חייב לא רק להיכנס לתאים אלא גם לבוא לידי ביטוי (אשר כרוך, בין היתר, ייבוא גרעיני, שעתוק, ותרגום, כל אחד מהם יכול להפחית את יעילות הביטוי). ניתן לעקוף את היעילות הנמוכה של ביטוי פלסמיד טעון חרוזים באמצעות פרוטוקולי טרנספקטיון חלופיים, כגון ליפופקטיון, לפני טעינת חלבונים או בדיקות16,27. בנוסף, דגירה של תאים במדיה אופטימלית למשך 30 דקות לפני טעינת חרוזים עשויה לסייע בביטוי פלסמיד. בשל ביטוי פלסמיד נמוך, טעינת חרוזים לא שימשה לעתים קרובות כחלופה transfection מבוסס ליפופקטיון במעבדה זו. היוצא מן הכלל היחיד הוא כאשר חלבון מטוהר, כגון Fab, הוא להיות טעון במשותף, ובמקרה זה זה די נוח לחרוז-לטעון את החלבון plasmid באותו זמן. יתר על כן, עבור תאים שאינם מגיבים או סובלניים ליפופקטיון, טעינת חרוזים עשויה לספק שיטה חלופית, אם כי יעילות נמוכה, לביטוי פלסמיד חולף.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדת סטסביץ’ על אינספור שיחות שעזרו לשפר ולפתח פרוטוקול זה. באופן ספציפי, ד”ר לינדה פוררו וד”ר פיל פוקס לעצה על חרוזים טעינת סוגי תאים שונים. ברצוננו להודות מקרב לב לד”ר יוקו היאשי-טקאנאקה, ד”ר יוקו סאטו וד”ר הירושי קימורה על ששיתפו את פרוטוקול טעינת חרוזי הזכוכית שלהם. אנו מודים מאוד לד”ר אשוק פראסאד וד”ר דייגו קראף על ששיתפו בנדיבות את פרוטוקולי טעינת החרוזים שלהם להכנסת חלקיקים אנאורגניים לתאים. אנו מודים לד”ר טראוויס סנדרס, קרייג מרשל וד”ר תומאס סנטאנג’לו על ששיתפו בנדיבות את ריאגנט הרנ”א שלהם. ALK, MNS, CAC, GG ו- TJS נתמכו על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R35GM119728 ומענק הקריירה של הקרן הלאומית למדע (NSF) MCB-1845761, שניהם ל- TJS. CAC נתמך גם על ידי פרס NSF NRT DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |