비드 로딩은 단백질, 플라스미드 및 입자를 부착 된 포유류 세포로 소개합니다. 이 셀 로딩 기술은 저렴하고 빠르며 세포 건강에 실질적으로 영향을 미치지 않습니다. 그것은 살아있는 세포 화상 진찰에 가장 적합합니다.
많은 살아있는 세포 화상 진찰 실험은 세포 내의 레이블 또는 기능을 위하여 외인성 입자 (예를 들면, 펩티드, 항체, 구슬)를 이용합니다. 그러나, 그것의 막을 통해 세포로 단백질을 소개하는 것은 어렵습니다. 현재 방법의 제한된 선택은 낮은 효율성으로 어려움을 겪고, 비용이 많이 들고 기술적으로 까다로운 장비 또는 좁은 매개 변수 내에서 의 기능을 필요로 합니다. 여기에서, 우리는 살아있는 인간 세포로 DNA, RNA 및 단백질을 적재하기 위한 상대적으로 간단하고 비용 효과적인 기술을 기술합니다. 비드 로딩은 세포막에 일시적인 기계적 중단을 유도하여 거대 분자가 부착된 살아있는 포유류 세포에 들어갈 수 있도록 합니다. 실험당 0.01 USD 미만의 비드 로딩은 셀 로딩 방법이 가장 저렴합니다. 또한, 비드 로딩은 세포를 실질적으로 스트레스를 주거나 생존력이나 증식에 영향을 미치지 않습니다. 이 원고는 비드 로딩 절차, 적응, 변형 및 기술적 한계의 단계를 설명합니다. 이 방법론은 살아있는 세포 화상 진찰에 특히 적합하지만 단백질, 구슬, RNA 또는 플라스미드를 살아있는, 부착 된 포유류 세포로 도입해야하는 다른 응용 분야에 대한 실용적인 솔루션을 제공합니다.
거대분자를 포유류 세포로 적재하면 세포의 혈장 막1을교차할 수 있는 방법론이 필요합니다. 여러 가지 방법은 지방혈 성 전환2 및 diethylaminoethyl-dextran transfection3을포함하여 트랜스페션을 통해 포유류 세포로 플라스미드를 도입할 수 있다. 그러나, 단백질 또는 막 불투과성 입자를 세포로 적재하는 방법은 더 제한적이다.
여러 가지 기술을 사용하여 이 어려운 장애물을 우회했습니다. 첫째, 미세 주입은 현미경4에서살아있는 세포로 마이크로 피펫을 통해 입자를 전달합니다. 틀림없이 가장 통제되고 가장 침습적인 방법이지만, 이 기술은 세포가 하나씩 로드되어야 하기 때문에 상대적으로 낮은 처리량입니다. 또한, 미세 분사에는 특수 장비가 필요하며 기술적으로 요구됩니다.
둘째, 전기기화는 전압 유도 막중단5,6,7을통해 세포에 단백질을 전자 주입하는 방법입니다. 그러나,이 방법은 다시 전문, 비싼 장비를 필요로하고, 충격은 세포 스트레스와 사망을 일으킬 수 있습니다. 또한, 세포는 전기기화 전에 트립시화되어야 하며, 이후에 보충되어야 하며, 세포가 전기포화 후 조사할 수 있는 기간을 제한한다.
셋째, 세포막은 일시적이고 가역적인 투과화8,9를위해 화학적으로 변형될 수 있다. 연쇄상 구균-O 로딩은 세포막에 내독신을 삽입하여 일시적인 모공을 형성하여 단백질과 DNA 플라스미드를 포함한 외인성 막 불투과성 입자가세포(10)에진입할 수 있도록 한다. 2시간 회복 후, 약 절반의 세포가 이러한 모공을 수리하고 용액에서 입자를 내면화하는 것을 중단한다. 그러나,이 기술은 긴 회복 시간을 필요로하고 내독소를 용납 할 수없는 세포 유형과 호환되지 않습니다.
넷째, 기계적 중단은세포막(11)의물리적 인 혼란을 통해 세포에 입자를 로드한다. 이것은 셀12,13위에 긁힘, 긁기 및 롤링 구슬을 포함하여 여러 가지 방법으로 수행 될 수있다. 1987년 초, 비드는 기계적으로14개의단백질을 세포로 적재하는 데 사용되어 왔다. 최근에는 비드 로딩 기술이 단백질 을 넘어 플라스미드 및 RNA의 하중을 포함하도록 최적화되고 적응되어 여기에 설명된 바와 같이.
비드 로딩은 단백질과 플라스미드를 부착된 인간 세포에 적재하는 쉽고 저렴하며 빠른 방법입니다. 유리 구슬은 세포 위에 짧게 압연되어 일시적으로 세포 막을 방해합니다. 이를 통해 솔루션의 파티클이 입력할 수 있습니다. 비드 로딩은 효율이 낮기 때문에 단일 분자 또는 단일 세포 현미경 실험에 가장 적합합니다. 비드 로딩은 단편화된 항체(Fab),15,16가지 정제 단백질s scFvs, 17내트라내트,18,19또는 mRNA 코트 단백질, 예를 들어 MS2 코트 단백질(MCP) 20,21을포함한 다양한단백질을 도입할수 있다. 플라스미드 발현 벡터는 또한 단백질 용액에 첨가될 수 있고 동시에 비드로드가22,23,24,25일된다.
단백질과 플라스미드를 넘어, 250nm 폴리스티렌 구슬만큼 큰 분자는 비드 로딩 (개인 통신)을 통해 세포로 도입되었습니다. 비드 하중은 엄청나게 저렴하며, 재료 실험당 0.01 USD 미만의 비용이 들며 추가 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. 이미징 챔버의 중앙 14mm 직경 마이크로웰에 있는 세포만로드되기 때문에 실험당 사용되는 프로브의 양을 최소화함으로써 비용이 더욱 절감된다. 제한된 적재 영역은 비드 로딩이 벌크 셀 로딩에 적합하지 않다는 것을 의미합니다.
이 원고는 비드 로딩 장치를 구성하고 실험을 수행하는 방법을 포함하여 비드 로딩 프로세스를 제시합니다. 그것은 단백질, RNA 및 DNA가 각종 세포 모형으로 로드될 수 있고, 동시에 구슬장한 단백질이 높게 연관된 세포 농도 및 상대적으로 낮은 분산이 있다는 것을 보여줍니다. 또한 단백질, 플라스미드 또는 RNA의 세포 유형 및 적재에 기초한 프로토콜의 변이도 논의된다. 구슬은 세포막을 천포하고 방해하는 것으로 생각되지만, 적절하게 수행될 때 비드 로딩 공정은 이미징 챔버의 바닥에서 소수의 세포만 제거합니다. 짧은 회복 기간 후에, 세포는 성장하고 분할하는 것을 계속합니다. 이러한 방법론은 단일 분자 단백질 및 RNA 추적, 번역 후 변형 검출, 동적 세포 메커니즘의 관찰 또는 세포 외 국소화 모니터링15,16,22,26,27을포함하는 살아있는 세포 현미경실험에이상적입니다.
여기에 설명된 비드 로딩 기술은 거대 분자 및 기타 입자를 부착 세포로 도입하는 비용 효율적이고 시간 효율적인 방법입니다. 이 다목적 공정은단백질(도 2A)15,16,26,27,단백질과 플라스미드(도2B,C)22, 25,RNA(도4C),100 및 250nm 폴리스티렌 비드(개인 서신), 합성 염료39 또는 퀀텀닷34,40을 로드할 수있습니다. . 비드 로딩은 다른 유형의 멤브레인 불투과성 입자를 로드할 수 있습니다. 가장 자주 사용되는 응용 프로그램은 항체 또는 Fabs를 적재하여 번역 후 변형(PTM)과 같은 내인성 전형체를 살아있는 세포로 표적화하는 것입니다. PTM과 같은 표적은 종종 확립된 PTM 특이적, 유전적으로 인코딩된 프로브41,42없이 살아있는 세포에 라벨을 붙이기 어렵다. 대조적으로, 비드 로딩은 여러 유형의 프로브, 리포터 또는 기타 분자 도구를 동일한 세포로 함께 도입하여 여러 판독을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 우리는 비드 로딩이 다양한 거대 분자 또는 입자를적재하는 데 유용한 기술이 될 것으로 예상합니다.
비드 로딩의 주요 장점은 저렴한 비용입니다 : 각 실험 비용은 0.01 USD 미만입니다. 비드 로더 장치는 다른 셀 로딩 방법보다 훨씬 저렴한 재료로 150 달러까지 저렴하게 만들 수 있습니다. 비드 로더 장치의 비용은 재사용 가능한 금속 챔버를 플라스틱 챔버로 대체하여 $10 미만으로 더 줄일 수 있습니다. 이를 위해 35mm 챔버에 구멍을 뚫거나 35mm 유리 바닥 챔버에서 유리를 제거한 다음 테이프로 메쉬를 제자리에 단단히 고정시하십시오. 장치 대신, 비드 로딩은 넓은 보어 1000 μL 파이펫 팁을 사용하여 세포에 구슬을 스쿱하고 뿌릴 수도 있지만, 이러한 변화로 인해 구슬의 단층층을 세포에 뿌리기가 어렵다(단계 4.6).
비드 로딩의 또 다른 장점은 세포가 정상 전체 형태를 유지하고, 빠르게 회복하고, 적어도 U2OS, RPE1 및 HeLa 세포가 여기에서 연구한 다른 세포주를 위해 연구된 다른 세포주를 위해 계속 성장하고 분열할 수 있다는것입니다(그림 3; 그림 4A,B; 보충 비디오 1; 및 표 1)31. 비드 로딩 하는 동안, 세포는 물리적 스트레스를 겪고 때로는 이탈 및 껍질 (세포의 ~5%는 최적의 조건에서 벗겨, 하지만 더 큰 세포 손실 비드 로딩수행 너무 강제로 수행 되 거나 너무 많은 유리 구슬 세포 위에 로드 되는 경우 발생할 수 있습니다., 그림 3B에묘사 된 대로). 그러나, 커버슬립에 부착된 비드로드 셀은 일반적으로 건강하게 나타나며 비드 로딩 후 30분 으로 즉시 이미지화될 수있다(도 3A). 우리는 일반적으로 세포가 30 분 복구 기간을 허용하지만 더 빨리 비드 후 로딩이 가능하다는 것을 예상합니다.
이 기술의 주요 단점은 세포가 적재 하는 동안 사소한 물리적 스트레스를 견딜 수 있어야 하 고 커버 슬립에 단단히 부착 유지. 코팅 된 플레이트 (예 : HEK 및 줄기 세포)에서 자란 가난한 / 비 부착 세포 주 또는 세포는 종종 비드 로딩 중에 부드러운 도청시 분리됩니다. 또한, 경험은 기본 뉴런이 비드 로딩에 너무 민감하다는 것을 보여주었습니다.
비드 로딩은 단일 세포 또는 단일 분자 실험에 가장 적합합니다. 우리의 경험에서, 비드 로딩은 약 20-40 % 단백질 적재 효율을 가지며, 비드로드 세포의 ~20 %는 또한 공동로드 플라스미드(도 2A,B)를표현했다. 따라서, 비드 로딩 플라스미드는 플라스미드가 세포를 입력할 뿐만 아니라 표현되어야 하기 때문에 비드 로딩 정제 단백질보다 단백질 발현에 덜 효율적일 수 있다(무엇보다도 핵 수입, 전사 및 번역이 포함되며, 각각은 발현 효율을 낮출 수 있다). 비드 로드 된 플라스미드 발현의 낮은 효율은 비드 로딩 단백질 또는 프로브(16,27)전에 지방 흡입과 같은 대체 경질 프로토콜을 사용하여 우회 할 수 있습니다. 또한, 비드 로딩 전에 30분 동안 최적의 매체에서 세포를 배양하면 플라스미드 발현을 지원할 수 있다. 낮은 플라스미드 발현으로 인해 비드 하중은 이 실험실에서 리포펙션 기반 의 전환에 대한 대안으로 자주 사용되지 않았습니다. 유일한 예외는 Fab과 같은 정제 된 단백질이 공동 로드될 때이며, 이 경우 단백질과 플라스미드를 동시에 비드로드하는 것이 매우 편리합니다. 더욱이, 리포페션에 반응하지 않거나 내성이 없는 세포의 경우, 비드 로딩은 과도 플라스미드 발현을 위한 저효율, 방법이기는 하지만 대체적인 것을 제공할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 프로토콜을 개선하고 개발하는 데 도움이 되는 수많은 대화에 대해 Stasevich 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 특히 린다 포레로 박사와 필 폭스 박사는 다양한 세포 유형에 대한 비드 로딩에 대한 조언을 구사합니다. 하야시 다카나카 요코 박사, 사토 유코 박사, 기무라 히로시 박사가 유리 비드 로딩 프로토콜을 공유해 주신 것에 대해 진심으로 감사드립니다. 아쇼크 프라사드 박사와 디에고 크라프 박사에게 무기 입자를 세포에 도입하기 위한 비드 로딩 프로토콜을 아낌없이 공유해 주셔서 대단히 감사합니다. 트래비스 샌더스 박사, 크레이그 마셜 박사, 토마스 산탄젤로 박사에게 표기된 RNA 시약을 아낌없이 공유해 주셔서 감사합니다. ALK, MNS, CAC, GG 및 TJS는 국립 보건원 (NIH) 보조금 R35GM119728 및 국립 과학 재단 (NSF) 경력 보조금 MCB-1845761에 의해 지원되었다, 모두 TJS에. CAC는 또한 NSF NRT 상 DGE-1450032에 의해 지원되었다.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |