ビーズローディングは、タンパク質、プラスミド、および粒子を付着した哺乳類細胞に導入します。この細胞ローディング技術は、安価で迅速であり、細胞の健康に実質的に影響を与えません。ライブセルイメージングに最適です。
多くの生細胞イメージング実験では、外因性粒子(例えば、ペプチド、抗体、ビーズ)を用いて細胞内に標識または機能する。しかし、膜を横切って細胞にタンパク質を導入することは困難です。現在の方法の限定的な選択は、低効率に苦労し、高価で技術的に要求の厳しい機器、または狭いパラメータ内の機能を必要とします。ここでは、DNA、RNA、タンパク質を生きたヒト細胞にロードするための比較的シンプルで費用対効果の高い手法について述べています。ビーズの負荷は細胞膜に一時的な機械的破壊を誘発し、高分子が付着した生きた哺乳類細胞に入ることを可能にする。実験あたり0.01米ドル未満では、ビードローディングは、利用可能な最も安価なセルローディング方法です。さらに、ビーズローディングは、細胞に実質的にストレスを与えたり、その生存率や増殖に影響を与えたりしません。この原稿は、ビーズのロード手順、適応、バリエーション、および技術的な制限事項のステップを説明しています。この方法論は、生細胞イメージングに特に適していますが、タンパク質、ビーズ、RNA、またはプラスミドを生きた、付着性哺乳類細胞に導入する必要がある他の用途に対する実用的なソリューションを提供します。
高分子を哺乳動物細胞にロードするには、細胞の形質膜1を横切ることができる方法論が必要である。いくつかの方法は、トランスフェクションを介して哺乳動物細胞にプラスミドを導入することができる、リポソームトランスフェクション2 およびジエチルアミノエチルデキストラントランスフェクション3を含む。しかし、タンパク質や膜不透過性粒子を細胞にロードする方法は、より限定的である。
いくつかの技術は、様々な戦略を使用して、この困難なハードルをバイパスしています。まず、マイクロインジェクションは、マイクロピペットを介してマイクロピペットを介して、マイクロ顕微鏡4の下で生きた細胞に粒子を送達する。間違いなく最も制御され、最も侵襲性の低い方法ですが、細胞は1つずつロードされなければならないので、この技術は比較的低いスループットです。さらに、マイクロインジェクションには特殊な機器が必要であり、技術的に要求が厳しい。
第二に、エレクトロポレーションは、電圧誘発膜破壊5、6、7を介して細胞にタンパク質をエレクトロ注入する方法である。しかし、この方法は再び特殊で高価な機器を必要とし、ショックは細胞のストレスや死亡率を引き起こす可能性があります。さらに、細胞はエレクトロポレーションの前にトリプシン化され、その後再入植され、細胞がエレクトロポレーション後に調査できる時間枠を制限しなければならない。
第3に、細胞膜は、一時的に、可逆的な透過性8、9のために化学的に修飾されてもよい。ストレプトライジン-Oローディングは、一時的な細孔を形成する細胞膜に内毒素を挿入し、タンパク質およびDNAプラスミドを含む外因性膜不透過性粒子が細胞10に入ることを可能にする。2時間の回復後、細胞の約半分がこれらの毛穴を修復し、溶液からの内在化粒子を停止する。しかし、この技術は長い回復時間を必要とし、内毒素を許容できない細胞型と互換性がありません。
第4に、機械的破壊は、細胞膜11の物理的摂動を通じて粒子を細胞に負荷する。これは、セル12,13の上に引っ掻き、掻き取り、およびロールビーズを含む複数の方法で行うことができます。早くも 1987, ビーズは機械的に細胞にタンパク質をロードするために使用されています14.最近では、ここで説明するように、ビーズローディング技術は、プラスミドとRNAの負荷を含むようにタンパク質を超えて最適化され、適応されています。
ビーズローディングは、タンパク質とプラスミドを付着性ヒト細胞にロードするための簡単で安価で迅速な方法です。ガラスビーズは細胞の上に一時的に転がされ、細胞膜を一時的に破壊する。これにより、溶液中のパーティクルが入ります。ビーズの負荷は効率が低いため、単一分子または単一細胞顕微鏡実験に最適です。ビーズローディングは、断片化した抗体(Fab)、15、16個の精製タンパク質(scFvs、17イントラボディ、18、19、またはmRNAコートタンパク質、例えばMS2コートタンパク質)20、21を含む多種多様なタンパク質を導入することができる。プラスミド発現ベクターは、タンパク質溶液に添加することも可能であり、ビーズを同時に22、23、24、25にロードする。
タンパク質やプラスミドを超えて、250 nmのポリスチレンビーズの大きさの分子がビーズローディング(パーソナルコミュニケーション)を介して細胞に導入されています。ビードの負荷は非常に安価で、材料の実験ごとに0.01 USD未満の費用がかかり、追加の高価な機器を必要としません。イメージングチャンバーの中央14mm径マイクロウェル内の細胞のみがロードされるため、実験ごとに使用されるプローブの量を最小限に抑えることで、コストがさらに削減されます。制限されたローディング領域は、ビーズのローディングがバルクセルのロードに適していないことを意味します。
この原稿は、ビーズローディング装置の構築や実験の実施方法を含む、ビーズのロードプロセスを示す。タンパク質、RNA、DNAは様々な細胞タイプにロードすることができ、同時にビーズをロードした2つの異なるタンパク質は、高相関性の高い細胞濃度と比較的低い分散を有することを示しています。また、タンパク質、プラスミド、またはRNAの細胞の種類と負荷に基づくプロトコルのバリエーションも議論されています。ビーズは細胞膜を穿穿および破壊すると考えられているが、適切に行われると、ビーズローディングプロセスは、イメージングチャンバの底部から少数の細胞のみを外に出す。短い回復期間の後, 細胞が成長し、分裂し続けます.この方法論は、単一分子タンパク質およびRNA追跡、翻訳後修飾検出、動的細胞機構の観察、または細胞内局在化モニタリング15、16、22、26、27を含む生細胞顕微鏡実験に最適である。
ここで説明するビーズローディング技術は、高分子やその他の粒子を接着細胞に導入するための費用対効果と時間効率の高い方法です。この多目的なプロセスは、タンパク質(図2A)15、16、26、27、タンパク質とプラスミドの組み合わせ(図2B、C)22、25、RNA(図4C)、100および250 nmポリスチレンビーズ(パーソナル対応)、合成染料39または量子ドット34、40をロードすることができます。.ビーズローディングは、他のタイプの膜不浸透性粒子を同様にロードする能力を有し得る。その最も頻繁に使用されるアプリケーションは、抗体またはFabsをロードして、翻訳後修飾(PTM)などの内在性エピトープを生細胞にロードすることです。PTMなどの標的は、PTM特異的に、遺伝的にコードされたプローブ41、42を確立せずに生細胞で標識することがしばしば困難である。これに対し、ビーズローディングでは、複数のプローブ、レポーター、その他の分子ツールを同時に同じセルに導入し、複数の読み出しを同時に監視することができます。ビーズの装填は、様々な高分子や粒子を装填するのに役立つ技術になると予想しています。
ビードローディングの主な利点は、低コストです:各実験は0.01 USD未満の費用がかかります。ビーズローダー装置は、他の細胞ローディング法よりも大幅に安価な合計〜150ドルの安価な材料を使用して簡単に作ることができます。再利用可能な金属チャンバーをプラスチック製のチャンバーに置き換えることで、ビーズローダー装置のコストをさらに10ドル以下に抑えることができます。このためには、35 mmのチャンバーに穴を開けるか、35 mmのガラス底のチャンバーからガラスを取り外し、その後、しっかりとテープで所定の位置にメッシュを固定します。装置の代わりに、ビードローディングは、広孔1000μLピペットチップを使用して細胞にビーズをすくい、振りかけることさえできますが、この変動は細胞にビーズの単層を振りかけるのが困難です(ステップ4.6)。
ビーズローディングのもう一つの利点は、細胞が正常な全体的な形態を保持し、急速に回復し、少なくともここで研究されたU2OS、RPE1、およびHeLa細胞および他の場所で研究された他の細胞株のために成長し、分裂し続けることができるということです(図 3;図 4A,B;補足ビデオ 1;および表 1)31.ビーズのロード中、細胞は物理的ストレスを受け、時には剥離や剥離(最適な条件下では細胞の5%が剥離するが、ビードの負荷が強くなりすぎたり、ガラスビーズが多すぎると細胞の上にロードされると細胞が大きく失われる可能性がある)。しかし、カバースリップに取り付けられたままのビーズを積んだ細胞は、通常、正常に見え、ビーズのロード後に30分ですぐに画像を作成できます(図3A)。我々は一般的に細胞に30分の回復期間を許可するが、より早くポストビーズのロードが可能であることを予想する。
この技術の大きな欠点は、細胞がロード中に軽微な物理的ストレスに耐えることができ、カバースリップにしっかりと付着し続ける必要があるということです。コーティングされたプレート(HEKおよび幹細胞など)上で成長した不十分/非接着性細胞株(HEKおよび幹細胞)は、しばしばビーズのローディング中に穏やかなタッピング時に剥離する。さらに、経験からは、一次ニューロンがビードの負荷に敏感すぎることが分かっています。
ビーズの負荷は単一細胞または単一分子の実験に最も適している。我々の経験では、ビーズローディングは約20〜40%のタンパク質負荷効率を有し、ビーズを積んだ細胞の約20%も共装プラスミドを発現した(図2A、B)。したがって、ビーズローディングプラスミドは、ビーズローディング精製タンパク質よりもタンパク質発現の効率が悪い可能性があります(特に、核輸入、転写、翻訳など、それぞれが発現効率を低下させる可能性があるため)。ビーズをロードしたプラスミド発現の低効率は、リポフェクションなどの代替トランスフェクションプロトコルを用いて、ビーズローディングタンパク質またはプローブ16,27の前に回避することができる。さらに、ビーズローディング前に30分間最適培地中の細胞をインキュベートすることは、プラスミドの発現を助けるかもしれない。低プラスミド発現のため、この研究室では、ビーズローディングは、リポフェクションベースのトランスフェクションの代替として使用されることがあまりありません。唯一の例外は、Fabなどの精製タンパク質が共装される場合であり、その場合は同時にタンパク質とプラスミドをビーズロードするのが非常に便利です。さらに、リポフェクションに対して反応しない、または不耐性である細胞に対して、ビーズローディングは、一過性プラスミド発現のための代替的な、低効率ではあるが、方法を提供し得る。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、このプロトコルを改善し、開発するのに役立った無数の会話のためにStasevichラボのメンバーに感謝しています。具体的には、リンダ・フォレロ博士とフィル・フォックス博士が、異なる細胞タイプのビーズのロードに関するアドバイスを求めています。ガラスビーズの積み込みプロトコルを共有してくださった林高中陽子先生、佐藤裕子先生、木村博先生に心より感謝申し上げます。アショク・プラサド博士とディエゴ・クラプ博士は、無機粒子を細胞に導入するためのビーズローディングプロトコルを寛大に共有してくれたことに非常に感謝しています。トラヴィス・サンダース博士、クレイグ・マーシャル博士、トーマス・サンタンジェロ博士がラベル付きRNA試薬を寛大に共有してくれたことに感謝しています。ALK、MNS、CAC、GG、TJSは、国立衛生研究所(NIH)助成金R35GM119728と国立科学財団(NSF)キャリア助成金MCB-1845761、両方のTJSに支援されました。CACは、NSF NRTアワードDGE-1450032によってもサポートされました。
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |