Das Laden von Perlen führt Proteine, Plasmide und Partikel in anhaftende Säugetierzellen ein. Diese Zellladetechnik ist kostengünstig, schnell und beeinträchtigt die Zellgesundheit nicht wesentlich. Es eignet sich am besten für die Bildgebung von lebenden Zellen.
Viele Lebendzell-Bildgebungsexperimente verwenden exogene Partikel (z. B. Peptide, Antikörper, Perlen), um Zellen zu kennzeichnen oder zu funktionieren. Es ist jedoch schwierig, Proteine über ihre Membran in eine Zelle einzuführen. Die begrenzte Auswahl an aktuellen Methoden kämpft mit geringem Wirkungsgrad, erfordert teure und technisch anspruchsvolle Geräte oder funktioniert innerhalb enger Parameter. Hier beschreiben wir eine relativ einfache und kostengünstige Technik, um DNA, RNA und Proteine in lebende menschliche Zellen zu laden. Die Perlenbelastung induziert eine vorübergehende mechanische Störung der Zellmembran, so dass Makromoleküle in adhärente, lebende Säugetierzellen eindringen können. Mit weniger als 0,01 USD pro Experiment ist das Laden von Perlen die kostengünstigste verfügbare Zelllademethode. Darüber hinaus belastet die Beladung von Perlen die Zellen nicht wesentlich und beeinträchtigt ihre Lebensfähigkeit oder Proliferation nicht. Dieses Manuskript beschreibt die Schritte des Perlenladeverfahrens, Anpassungen, Variationen und technische Einschränkungen. Diese Methodik eignet sich besonders für die Bildgebung lebender Zellen, bietet aber eine praktische Lösung für andere Anwendungen, die die Einführung von Proteinen, Perlen, RNA oder Plasmiden in lebende, adhärente Säugetierzellen erfordern.
Das Laden von Makromolekülen in Säugetierzellen erfordert eine Methodik, die es ihnen ermöglicht, die Plasmamembran der Zelle zu durchqueren1. Mehrere Methoden können Plasmide durch Transfektion in Säugetierzellen einführen, einschließlich liposomaler Transfektion2 und Diethylaminoethyl-Dextran-Transfektion3. Methoden zum Laden von Proteinen oder membrandurchlässigen Partikeln in Zellen sind jedoch begrenzter.
Mehrere Techniken haben diese schwierige Hürde mit verschiedenen Strategien umgangen. Zunächst liefert die Mikroinjektion Partikel durch eine Mikropipette in lebende Zellen untereinem Mikroskop 4. Obwohl diese Technik wohl die kontrollierteste und am wenigsten invasive Methode ist, ist sie relativ durchsatzarm, da die Zellen nacheinander geladen werden müssen. Darüber hinaus erfordert die Mikroinjektion spezielle Ausrüstung und ist technisch anspruchsvoll.
Zweitens ist die Elektroporation eine Möglichkeit, Proteine durch spannungsinduzierte Membranaufschluss in Zellen zu injizieren5,6,7. Diese Methode erfordert jedoch wiederum spezielle, teure Ausrüstung, und der Schock kann Zellstress und Mortalität verursachen. Darüber hinaus müssen Zellen vor der Elektroporation trypsinisiert und anschließend neu plattiert werden, wodurch der Zeitrahmen begrenzt wird, in dem Zellen nach der Elektroporation untersucht werden können.
Drittens können Zellmembranen chemisch für eine vorübergehende, reversible Permeabilisierung modifiziert werden8,9. Streptolysin-O-Ladung führt ein Endotoxin in Zellmembranen ein, das temporäre Poren bildet, so dass exogene membranimpermeable Partikel, einschließlich Proteine und DNA-Plasmide, in Zellen eindringenkönnen 10. Nach einer 2- h-Erholung repariert etwa die Hälfte der Zellen diese Poren und stoppt die Internalisierung von Partikeln aus der Lösung. Diese Technik erfordert jedoch eine lange Erholungszeit und ist mit Zelltypen, die Endotoxine nicht vertragen, nicht kompatibel.
Viertens belastet die mechanische Störung Partikel durch physikalische Störung der Zellmembran in die Zellen11. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen, einschließlich Kratzen, Abkratzen und Rollen von Perlen auf den Zellen12,13. Bereits 1987 wurden Perlen verwendet, um Proteine mechanisch in Zellen zu laden14. In jüngerer Zeit wurde die Perlenladetechnik optimiert und über Proteine hinaus angepasst, um die Beladung von Plasmiden und RNA einzubeziehen, wie hier beschrieben.
Das Laden von Perlen ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode zum Laden von Protein und Plasmiden in adhärente menschliche Zellen. Glasperlen werden kurz auf Zellen gerollt und stören vorübergehend ihre Zellmembran. Dadurch können Partikel in Lösung eindringen. Da die Perlenbeladung einen geringen Wirkungsgrad aufzeigt, eignet sie sich am besten für Einzelmolekül- oder Einzelzellmikroskopieexperimente. Das Laden von Perlen kann eine Vielzahl von Proteinen einführen, darunter fragmentierte Antikörper (Fab),15,16 gereinigte Proteine wie scFvs,17 Intrabodies,18,19oder mRNA-Coat-Proteine, z. B. MS2-Coat-Protein (MCP)20,21. Plasmidexpressionsvektoren können auch der Proteinlösung zugesetzt und gleichzeitig mit Perlen beladen werden22,23,24,25.
Neben Proteinen und Plasmiden wurden Moleküle mit einer Größe von bis zu 250 nm Polystyrolperlen über Perlenladung (persönliche Kommunikation) in die Zellen eingebracht. Das Laden von Perlen ist unglaublich kostengünstig, kostet weniger als 0,01 USD pro Experiment in Materialien und erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung. Die Kosten werden weiter reduziert, indem die Anzahl der pro Experiment verwendeten Sonden minimiert wird, da nur die Zellen im zentralen Mikrobrunnen mit einem Durchmesser von 14 mm einer Bildgebungskammer belastet werden. Es ist zu beachten, dass die begrenzte Ladefläche bedeutet, dass die Perlenbeladung nicht ideal für die Beladung von Schüttzellen ist.
Dieses Manuskript stellt den Perlenladeprozess vor, einschließlich der Konstruktion der Perlenladevorrichtung und der Durchführung eines Experiments. Es zeigt, dass Proteine, RNA und DNA in verschiedene Zelltypen geladen werden können und dass zwei verschiedene, gleichzeitig perlenbeladene Proteine stark korrelierte Zellkonzentrationen und relativ geringe Varianz aufweisen. Diskutiert werden auch Variationen im Protokoll, die auf dem Zelltyp und der Belastung von Protein, Plasmid oder RNA basieren. Obwohl angenommen wird, dass Perlen die Zellmembran perforieren und stören, verdrängt der Perlenbeladungsprozess bei entsprechender Durchführung nur eine kleine Anzahl von Zellen vom Boden der Bildgebungskammer. Nach einer kurzen Erholungsphase wachsen und teilen sich die Zellen weiter. Diese Methodik ist ideal für Experimente in der Lebendzellmikroskopie, einschließlich Einzelmolekülprotein- und RNA-Tracking, post-translationaler Modifikationsdetektion, Beobachtung dynamischer zellulärer Mechanismen oder subzelluläre Lokalisierungsüberwachung15,16,22,26,27.
Die hier beschriebene Perlenbeladungstechnik ist eine kostengünstige und zeiteffiziente Methode, um Makromoleküle und andere Partikel in adhärente Zellen einzuführen. Dieser vielseitige Prozess kann Protein (Abbildung 2A)15,16,26,27, eine Kombination aus Protein und Plasmiden ( Abbildung2B,C)22,25,RNA ( Abbildung4C), 100 und 250 nm Polystyrolperlen (persönliche Korrespondenz), synthetische Farbstoffe39 oder Quantenpunkte34,40 . Die Bead-Beladung kann auch andere Arten von membrandurchlässigen Partikeln belasten. Seine am häufigsten verwendete Anwendung ist das Laden von Antikörpern oder Fabs, um endogene Epitope, wie post-translationale Modifikationen (PTMs), in lebende Zellen zu zielen. Targets, wie PTMs, sind in lebenden Zellen ohne etablierte PTM-spezifische, genetisch kodierte Sonden oft schwer zu kennzeichnen41,42. Im Gegensatz dazu kann das Laden von Perlen mehrere Arten von Sonden, Reportern oder anderen molekularen Werkzeugen zusammen in dieselbe Zelle einführen, um mehrere Auslesungen gleichzeitig zu überwachen. Wir gehen davon aus, dass das Laden von Perlen eine nützliche Technik zum Laden einer Vielzahl von Makromolekülen oder Partikeln sein wird.
Ein großer Vorteil der Perlenbeladung sind die geringen Kosten: Jedes Experiment kostet weniger als 0,01 USD. Ein Perlenladegerät kann leicht mit kostengünstigen Materialien hergestellt werden, die insgesamt ~ $ 150 kosten, was deutlich billiger ist als jede andere Zelllademethode. Die Kosten für ein Perlenladegerät können weiter auf unter 10 US-Dollar gesenkt werden, indem die wiederverwendbare Metallkammer durch eine Kunststoffkammer ersetzt wird. Bohren Sie dazu entweder ein Loch in eine 35-mm-Kammer oder entfernen Sie das Glas aus einer 35-mm-Glasbodenkammer, um das Netz dann sicher mit Klebeband zu befestigen. Anstelle einer Apparatur kann die Perlenbeladung sogar mit einer breit angelegten 1000 μL-Pipettenspitze durchgeführt werden, um Perlen auf Zellen zu schaufeln und zu streuen, obwohl diese Variation es schwierig macht, eine Monoschicht von Perlen auf Zellen zu streuen (Schritt 4.6).
Ein weiterer Vorteil der Perlenbeladung besteht darin, dass zellen die normale Gesamtmorphologie beibehalten, sich schnell erholen und weiter wachsen und sich teilen können, zumindest für die hier untersuchten U2OS-, RPE1- und HeLa-Zellen und für die anderen anderswo untersuchten Zelllinien(Abbildung 3; Abbildung 4A,B; Ergänzendes Video 1; und Tabelle 1)31. Während der Perlenbelastung unterliegen die Zellen körperlichem Stress und lösen sich manchmal ab und schälen sich (~ 5% der Zellen schälen sich unter optimalen Bedingungen, aber ein größerer Zellverlust kann auftreten, wenn die Perlenbeladung zu stark durchgeführt wird oder zu viele Glasperlen auf die Zellen geladen werden, wie in Abbildung 3Bdargestellt). Perlenbeladene Zellen, die an der Decke befestigt bleiben, erscheinen jedoch in der Regel gesund und können bereits 30 Minuten nach dem Laden der Perle abgebildet werden (Abbildung 3A). Wir erlauben den Zellen im Allgemeinen eine 30-minütige Erholungsphase, gehen aber davon aus, dass eine frühere Bildgebung nach dem Laden von Perlen möglich ist.
Ein großer Nachteil dieser Technik ist, dass die Zellen in der Lage sein müssen, leichten körperlichen Belastungen während der Belastung standzuhalten und sicher am Abdeckrutsch festzuhalten. Schlecht/nicht adhärente Zelllinien oder Zellen, die auf beschichteten Platten gezüchtet wurden (z. B. HEK und Stammzellen), lösen sich oft beim sanften Klopfen während der Perlenbeladung. Darüber hinaus hat die Erfahrung gezeigt, dass primäre Neuronen zu empfindlich für die Perlenbelastung sind.
Die Perlenbeladung eignet sich am besten für Einzelzell- oder Einzelmolekülexperimente. Nach unserer Erfahrung hat die Perlenbeladung eine Proteinbeladungseffizienz von etwa 20-40%, und ~ 20% der perlenbeladenen Zellen exprimierten auch ein co-geladenes Plasmid (Abbildung 2A, B). Daher können Perlenladeplasmide für die Proteinexpression weniger effizient sein als Perlenlader gereinigte Proteine, da Plasmide nicht nur in Zellen eindringen, sondern auch exprimiert werden müssen (was unter anderem Kernimport, Transkription und Translation beinhaltet, von denen jede die Expressionseffizienz verringern kann). Die geringe Effizienz der perlenbeladenen Plasmidexpression kann durch die Verwendung alternativer Transfektionsprotokolle wie Lipofektion vor perlenbeladenen Proteinen oder Sonden16,27umgangen werden. Darüber hinaus kann die Inkubation von Zellen in optimalen Medien für 30 Minuten vor dem Laden der Perlen die Plasmidexpression unterstützen. Aufgrund der geringen Plasmidexpression wurde die Perlenbelastung in diesem Labor nicht oft als Alternative zur lipofektionsbasierten Transfektion verwendet. Die einzige Ausnahme ist, wenn ein gereinigtes Protein, wie Fab, mitbeladen werden soll, in diesem Fall ist es sehr praktisch, das Protein und das Plasmid gleichzeitig mit Perlen zu laden. Darüber hinaus kann die Perlenbelastung für Zellen, die nicht auf Lipofektionen reagieren oder diese nicht verträglich sind, eine alternative, wenn auch wenig effizienter Methode für die transiente Plasmidexpression bieten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern des Stasevich-Labors für unzählige Gespräche, die dazu beigetragen haben, dieses Protokoll zu verbessern und weiterzuentwickeln. Insbesondere Dr. Linda Forero und Dr. Phil Fox für Ratschläge zum Laden verschiedener Zelltypen. Wir möchten Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato und Dr. Hiroshi Kimura herzlich für die Weitergabe ihres Glasperlenladeprotokolls danken. Wir sind Dr. Ashok Prasad und Dr. Diego Krapf sehr dankbar, dass sie ihre Perlenladeprotokolle für die Einführung anorganischer Partikel in Zellen großzügig geteilt haben. Wir danken Dr. Travis Sanders, Craig Marshall und Dr. Thomas Santangelo für die großzügige Weitergabe ihres markierten RNA-Reagenzes. ALK, MNS, CAC, GG und TJS wurden durch den National Institutes of Health (NIH) Grant R35GM119728 und den National Science Foundation (NSF) CAREER Grant MCB-1845761 unterstützt, beide an TJS. CAC wurde auch durch den NSF NRT Award DGE-1450032 unterstützt.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |