मनका लोडिंग प्रोटीन, प्लाज्मिड, और कणों को अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं में पेश करती है। यह सेल लोडिंग तकनीक सस्ती, तेजी से है, और सेल स्वास्थ्य को काफी हद तक प्रभावित नहीं करती है। यह लाइव-सेल इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त है।
कई लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोग कोशिकाओं के भीतर लेबल या कार्य करने के लिए बहिर्जात कणों (जैसे, पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, मोती) का उपयोग करते हैं। हालांकि, इसकी झिल्ली के पार एक सेल में प्रोटीन शुरू करना मुश्किल है। वर्तमान तरीकों का सीमित चयन कम दक्षता के साथ संघर्ष करता है, महंगे और तकनीकी रूप से मांग करने वाले उपकरणों, या संकीर्ण मापदंडों के भीतर कार्यों की आवश्यकता होती है। यहां, हम जीवित मानव कोशिकाओं में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन लोड करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तकनीक का वर्णन करते हैं। मनका लोडिंग कोशिका झिल्ली में एक अस्थायी यांत्रिक व्यवधान लाती है, जिससे मैक्रोमॉलिक्यूल्स अनुयायी, जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। प्रति प्रयोग 0.01 अमरीकी डॉलर से कम पर, मनका लोडिंग सबसे कम महंगी सेल लोडिंग विधि उपलब्ध है। इसके अलावा, मनका लोडिंग कोशिकाओं को काफी तनाव नहीं देती है या उनकी व्यवहार्यता या प्रसार को प्रभावित नहीं करती है। यह पांडुलिपि मनका लोडिंग प्रक्रिया, अनुकूलन, विविधताओं और तकनीकी सीमाओं के चरणों का वर्णन करती है। यह पद्धति विशेष रूप से लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन अन्य अनुप्रयोगों के लिए एक व्यावहारिक समाधान प्रदान करती है जिसमें प्रोटीन, मोती, आरएनए, या प्लाज्मिड की शुरुआत की आवश्यकता होती है, जो जीवित, अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं में होता है।
स्तनधारी कोशिकाओं में मैक्रोमॉलिक्यूल्स लोड करने से कार्यप्रणाली की आवश्यकता होती है जो उन्हें कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली को पार करने की अनुमति देती है1। कई तरीके ट्रांसफैक्शन के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मिड पेश कर सकते हैं, जिसमें लिपोसोमल ट्रांसफैक्शन2 और डायथाइलमिनोएथिल-डेक्सट्रान ट्रांसफैक्शन3शामिल हैं। हालांकि, कोशिकाओं में प्रोटीन या झिल्ली-अभेद्य कणों को लोड करने के तरीके अधिक सीमित हैं।
कई तकनीकों ने विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करके इस कठिन बाधा को दरकिनार कर दिया है। सबसे पहले, माइक्रोइंजेक्शन एक माइक्रोस्कोप4के तहत जीवित कोशिकाओं में एक माइक्रोपिपेट के माध्यम से कणों को बचाता है । यकीनन सबसे नियंत्रित और कम आक्रामक विधि, यह तकनीक अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है क्योंकि कोशिकाओं को एक-एक करके लोड किया जाना चाहिए। इसके अलावा, माइक्रोइंजेक्शन के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और तकनीकी रूप से मांग की जाती है।
दूसरा, इलेक्ट्रोपॉनेशन वोल्टेज-प्रेरित झिल्ली व्यवधान5,6,7के माध्यम से कोशिकाओं में प्रोटीन को इलेक्ट्रो-इंजेक्ट करने का एकतरीकाहै। हालांकि, इस विधि को फिर से विशेष, महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है, और सदमे सेल तनाव और मृत्यु दर का कारण बन सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपाउशन से पहले ट्रिप्सिनाइज्ड किया जाना चाहिए और बाद में उन्हें रिफ्लेम किया जाना चाहिए, जिस समय सीमा को सीमित किया जाना चाहिए जिस पर कोशिकाओं की इलेक्ट्रोपॉशन के बाद जांच की जा सकती है ।
तीसरा, कोशिका झिल्ली को अस्थायी, प्रतिवर्ती पारमेबिलाइजेशन8,9के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। स्ट्रेप्टोलिसिन-ओ लोडिंग कोशिका झिल्ली में एक एंडोटॉक्सिन सम्मिलित करता है, जो अस्थायी छिद्र बनाता है, जिससे प्रोटीन और डीएनए प्लाज्मिड सहित एक्सोजेनस झिल्ली-अभेद्य कणों को कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है10। 2 घंटे की वसूली के बाद, लगभग आधी कोशिकाएं इन छिद्रों की मरम्मत करती हैं और समाधान से कणों को आंतरिक रूप से रोकती हैं। हालांकि, इस तकनीक के लिए एक लंबे समय की वसूली समय की आवश्यकता होती है और सेल प्रकारों के साथ असंगत है जो एंडोटॉक्सिन को बर्दाश्त नहीं कर सकता है।
चौथा, यांत्रिक व्यवधान कोशिका झिल्ली11के भौतिक क्षोभ के माध्यम से कोशिकाओं में कणों लोड । यह कई तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें12, 13कोशिकाओं के ऊपर खरोंच, स्क्रैपिंग और रोलिंग मोती शामिल हैं। 1987 की शुरुआत में, मोतियों का उपयोग यांत्रिक रूप से14कोशिकाओं में प्रोटीन लोड करने के लिए किया गया है। हाल ही में, मनका लोडिंग तकनीक को प्रोटीन से परे अनुकूलित और अनुकूलित किया गया है ताकि प्लाज्मिड और आरएनए की लोडिंग को शामिल किया जा सके, जैसा कि यहां वर्णित है।
मनका लोडिंग प्रोटीन और प्लाज्मिड को अनुयायी मानव कोशिकाओं में लोड करने के लिए एक आसान, सस्ती और तेज विधि है। कांच के मोती संक्षेप में कोशिकाओं के ऊपर लुढ़का रहे हैं, अस्थाई रूप से उनके सेलुलर झिल्ली में खलल न डालें । यह समाधान में कणों को प्रवेश करने की अनुमति देता है। चूंकि मनका लोडिंग में कम दक्षता होती है, इसलिए यह एकल-अणु या एकल-कोशिका माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है। मनका लोडिंग खंडित एंटीबॉडी (फैब),15, 16शुद्ध प्रोटीन जैसे एससीएफवी,17 इंट्राबॉडी, 18,19,या एमआरएनए कोट प्रोटीन, जैसे, एमएस2 कोट प्रोटीन (एमसीपी)20, 21सहित विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पेश करसकतेहैं। प्लास्मिड एक्सप्रेशन वैक्टर को प्रोटीन समाधान और मनका-लोडेड में एक साथ 22 ,23,24,25भी जोड़ा जा सकता है।
प्रोटीन और प्लाज्मिड से परे, 250 एनएम पॉलीस्टीरिन मोतियों के रूप में बड़े अणुओं को मनका लोडिंग (व्यक्तिगत संचार) के माध्यम से कोशिकाओं में पेश किया गया है। मनका लोडिंग अविश्वसनीय रूप से सस्ती है, सामग्री में प्रति प्रयोग 0.01 अमरीकी डालर से कम लागत और कोई अतिरिक्त महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है। प्रति प्रयोग उपयोग की जाने वाली जांच की मात्रा को कम करके लागत को और कम किया जाता है क्योंकि केवल एक इमेजिंग कक्ष के केंद्रीय 14 मिमी व्यास माइक्रोवेल में कोशिकाएं भरी हुई हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीमित लोडिंग क्षेत्र का मतलब है कि मनका लोडिंग थोक-सेल लोडिंग के लिए आदर्श नहीं है।
यह पांडुलिपि मनका लोडिंग प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जिसमें मनका लोडिंग उपकरण का निर्माण करना और एक प्रयोग करना शामिल है। यह दर्शाता है कि प्रोटीन, आरएनए और डीएनए को विभिन्न कोशिका प्रकारों में लोड किया जा सकता है और दो अलग-अलग, साथ ही मनका-लोडेड प्रोटीन में अत्यधिक सहसंबद्ध सेलुलर सांद्रता और अपेक्षाकृत कम विचरण होता है। इसके अलावा चर्चा की सेल प्रकार और प्रोटीन, प्लाज्मिड, या आरएनए की लोडिंग के आधार पर प्रोटोकॉल में बदलाव कर रहे हैं । यद्यपि मोती कोशिका झिल्ली को छिद्रित और बाधित करने के लिए सोचा जाता है, जब उचित रूप से प्रदर्शन किया जाता है, तो मनका लोडिंग प्रक्रिया इमेजिंग कक्ष के नीचे से केवल थोड़ी संख्या में कोशिकाओं को उखाड़ फेंकती है। एक छोटी वसूली अवधि के बाद, कोशिकाओं को बढ़ने और विभाजित करने के लिए जारी है । यह पद्धति लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए आदर्श है, जिसमें एकल-अणु प्रोटीन और आरएनए ट्रैकिंग, ट्रांसलेशनल संशोधन का पता लगाने, गतिशील सेलुलर तंत्र का अवलोकन, या15, 16,22,26,27शामिलहैं।
यहां वर्णित मनका लोडिंग तकनीक मैक्रोमॉलिक्यूल्स और अन्य कणों को अनुयायी कोशिकाओं में पेश करने के लिए एक लागत प्रभावी और समय-कुशल विधि है। इस बहुमुखी प्रक्रिया में प्रोटीन(चित्रा 2A)15,16, 26,27,प्रोटीन और प्लाज्मिड्स (चित्र 2बी, सी)22,25,आरएनए(चित्रा 4 सी),100 और 250 एनएम पॉलीस्टीरिन मोती (व्यक्तिगत पत्राचार),सिंथेटिक रंग39 या क्वांटम34, 40का संयोजन लोड किया जा सकताहै। . मनका लोडिंग में अन्य प्रकार के झिल्ली-अभेद्य कणों को भी लोड करने की क्षमता हो सकती है। इसका सबसे अधिक बार उपयोग किया जाने वाला एप्लिकेशन एंटीओजेनस एपिटोप्स को लक्षित करने के लिए एंटीबॉडी या फैब्स लोड करने के लिए है, जैसे कि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम), लाइव कोशिकाओं में। पीटीएम जैसे लक्ष्य अक्सर स्थापित पीटीएम-विशिष्ट, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच41, 42के बिना जीवित कोशिकाओं में लेबल करना मुश्किलहोताहै। इसके विपरीत, मनका लोडिंग एक साथ कई readouts की निगरानी के लिए एक ही सेल में एक साथ जांच, संवाददाताओं, या अन्य आणविक उपकरणों के कई प्रकार शुरू कर सकते हैं। हम आशा करते हैं कि मनका लोडिंग विभिन्न प्रकार के मैक्रोमॉलिक्यूल्स या कणों को लोड करने के लिए एक उपयोगी तकनीक होगी।
मनका लोडिंग का एक प्रमुख लाभ कम लागत है: प्रत्येक प्रयोग की लागत 0.01 अमरीकी डॉलर से कम है। एक मनका लोडर उपकरण आसानी से कुल ~ $ 150 में लागत वाली सस्ती सामग्रियों का उपयोग करके बनाया जा सकता है, जो किसी भी अन्य सेल-लोडिंग विधि की तुलना में काफी कम महंगा है। एक मनका लोडर उपकरण की लागत को एक प्लास्टिक के साथ पुन: प्रयोज्य धातु कक्ष की जगह से $ 10 के तहत कम किया जा सकता है। इसके लिए, या तो 35 मिमी कक्ष में एक छेद ड्रिल करें या 35 मिमी ग्लास-बॉटम कक्ष से ग्लास को हटा दें, फिर टेप के साथ जगह में जाल को सुरक्षित रूप से जकड़ें। एक उपकरण के बदले में, मनका लोडिंग भी एक व्यापक बोर १० μL पिपेट टिप का उपयोग कर के लिए स्कूप और कोशिकाओं पर मोती छिड़क प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि इस बदलाव यह मुश्किल कोशिकाओं पर मोतियों की एक मोनोलेयर छिड़क (चरण ४.६) बनाता है ।
मनका लोडिंग का एक और लाभ यह है कि कोशिकाएं सामान्य समग्र आकृति विज्ञान को बनाए रख सकती हैं, तेजी से ठीक हो सकती हैं, और कम से कम U2OS, RPE1 और HeLa कोशिकाओं के लिए यहां अध्ययन की गई और अन्य सेल लाइनों के लिए कहीं और अध्ययन किया जासकता है (चित्र 3; चित्रा 4ए,बी; पूरक वीडियो 1; और तालिका 1)31. मनका लोडिंग के दौरान, कोशिकाओं को शारीरिक तनाव से गुजरना पड़ता है और कभी-कभी उखाड़ फेंकना और छीलना (~ 5% कोशिकाएं इष्टतम परिस्थितियों में छीलती हैं, लेकिन अधिक सेल हानि हो सकती है यदि मोतियों की लोडिंग बहुत जबरदस्ती की जाती है या बहुत सारे ग्लास मोती कोशिकाओं के ऊपर लोड किए जाते हैं, जैसा कि चित्र 3 बीमें दर्शाया गया है)। हालांकि, कवरस्लिप से जुड़ी रहने वाली मनका-लोडेड कोशिकाएं आमतौर पर स्वस्थ दिखाई देती हैं और मनका लोडिंग(चित्र 3 ए)के बाद 30 मिनट के रूप में इमेज की जा सकती हैं। हम आम तौर पर कोशिकाओं को 30-मिनट की वसूली अवधि की अनुमति देते हैं, लेकिन आशा करते हैं कि इमेजिंग जितनी जल्दी पोस्ट-मनका लोडिंग संभव है।
इस तकनीक की एक बड़ी खामी यह है कि कोशिकाओं को लोडिंग के दौरान मामूली शारीरिक तनाव को सहन करने में सक्षम होने की जरूरत है और कवरस्लिप के लिए सुरक्षित रूप से पालन करते रहते हैं। खराब/गैर-अनुयायी कोशिका रेखाएं या कोटेड प्लेटों (जैसे, एचईके और स्टेम सेल) पर उगाई जाने वाली कोशिकाएं अक्सर मनका लोडिंग के दौरान कोमल दोहन पर अलग होती हैं । इसके अलावा, अनुभव से पता चला है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स मनका लोडिंग के लिए बहुत संवेदनशील हैं।
मनका लोडिंग एकल कोशिका या एकल अणु प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है। हमारे अनुभव में, मनका लोडिंग में लगभग 20-40% प्रोटीन लोडिंग दक्षता है, और ~ 20% मनका-लोडेड कोशिकाओं ने भी सह-लोडेड प्लाज्मिड(चित्रा 2 ए,बी)व्यक्त किया है। इस प्रकार, मनका लोडिंग प्लाज्मिड प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कम कुशल हो सकता है क्योंकि प्लाज्मिड को न केवल कोशिकाओं में प्रवेश करना चाहिए बल्कि व्यक्त किया जाना चाहिए (जिसमें अन्य बातों के अलावा, परमाणु आयात, प्रतिलेखन और अनुवाद शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक अभिव्यक्ति दक्षता को कम कर सकता है)। मनका-भरी हुई प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की कम दक्षता को वैकल्पिक ट्रांसफैक्शन प्रोटोकॉल, जैसे लिपोफेक्शन का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, मनका लोड करने से पहले प्रोटीन लोड करना या16,27की जांच करता है। इसके अतिरिक्त, मनका लोडिंग से पहले 30 मिनट के लिए इष्टतम मीडिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग प्लास्मिड अभिव्यक्ति की सहायता कर सकता है। कम प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के कारण, मनका लोडिंग का उपयोग अक्सर इस प्रयोगशाला में लिपोफेक्शन-आधारित ट्रांसफैक्शन के विकल्प के रूप में नहीं किया जाता है। एकमात्र अपवाद यह है कि जब फैब जैसे शुद्ध प्रोटीन को सह-लोड किया जाना है, जिस स्थिति में एक ही समय में प्रोटीन और प्लाज्मिड को मनका-लोड करना काफी सुविधाजनक है। इसके अलावा, उन कोशिकाओं के लिए जो अनुत्तरदायी या लिपिशोधन के लिए असहिष्णु हैं, मनका लोडिंग एक वैकल्पिक, हालांकि कम दक्षता, क्षणिक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए विधि प्रदान कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
हम इस प्रोटोकॉल को बेहतर बनाने और विकसित करने में मदद करने वाली असंख्य बातचीत के लिए स्टैसेविच लैब के सदस्यों के आभारी हैं। विशेष रूप से, डॉ लिंडा Forero और डॉ फिल फॉक्स मनका लोडिंग विभिन्न सेल प्रकार पर सलाह के लिए। हम अपने ग्लास मनका लोडिंग प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए डॉ योको हयाशी-ताकानाका, डॉ युको सातो और डॉ हिरोशी किमुरा को ईमानदारी से धन्यवाद देना चाहते हैं । हम डॉ अशोक प्रसाद और डॉ डिएगो क्राफ के बहुत आभारी हैं कि वे कोशिकाओं में अकार्बनिक कणों को पेश करने के लिए अपने मनका लोडिंग प्रोटोकॉल को उदारतापूर्वक साझा करते हैं । हम डॉ ट्रैइज सैंडर्स, क्रेग मार्शल, और डॉ थॉमस सैंटएंजेलो के लिए आभारी हैं उदारता से अपने लेबल आरएनए अभिकर्ण साझा करने के लिए । ए एलके, एमएनएस, सीएसी, जीजी और टीजेएस को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R35GM119728 और नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ) कैरियर ग्रांट एमसीबी-1845761, दोनों टीजेएस के लिए समर्थित थे। सीएसी को एनएसएफ एनआरटी अवार्ड डीजेई-1450032 का भी समर्थन मिला।
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |