Perlelasting introduserer proteiner, plasmider og partikler i adherent pattedyrceller. Denne cellelasteteknikken er billig, rask og påvirker ikke cellehelsen betydelig. Den egner seg best for levende celleavbildning.
Mange levende celleavbildningsforsøk bruker eksogene partikler (f.eks. peptider, antistoffer, perler) til å merke eller fungere i celler. Det er imidlertid vanskelig å introdusere proteiner i en celle over membranen. Det begrensede utvalget av nåværende metoder sliter med lav effektivitet, krever dyrt og teknisk krevende utstyr, eller funksjoner innenfor smale parametere. Her beskriver vi en relativt enkel og kostnadseffektiv teknikk for lasting av DNA, RNA og proteiner i levende menneskelige celler. Perlelasting induserer en midlertidig mekanisk forstyrrelse av cellemembranen, slik at makromolekyler kan komme inn i adherent, levende pattedyrceller. På mindre enn 0,01 USD per eksperiment er perlelasting den billigste cellebelastningsmetoden som er tilgjengelig. Videre stresser perlebelastning ikke i vesentlig grad celler eller påvirker deres levedyktighet eller spredning. Dette manuskriptet beskriver trinnene i perlelastingsprosedyren, tilpasninger, variasjoner og tekniske begrensninger. Denne metoden er spesielt egnet for levende celleavbildning, men gir en praktisk løsning for andre applikasjoner som krever innføring av proteiner, perler, RNA eller plasmider i levende, tilhengerpattedyrceller.
Lasting av makromolekyler i pattedyrceller nødvendiggjør metodikk som gjør at de kan krysse cellens plasmamembran1. Flere metoder kan introdusere plasmider i pattedyrceller gjennom transfeksjon, inkludert liposomal transfeksjon2 og diethylaminoethyl-dextran transfection3. Imidlertid er metoder for lasting av proteiner eller membran-ugjennomtrengelige partikler i celler mer begrenset.
Flere teknikker har omgått dette vanskelige hinderet ved hjelp av ulike strategier. For det første leverer mikroinjeksjon partikler gjennom en mikropipette i levende celler under et mikroskop4. Selv om denne teknikken uten tvil er den mest kontrollerte og minst invasive metoden, er den relativt lav gjennomstrømning fordi celler må lastes en etter en. Videre krever mikroinjeksjon spesialisert utstyr og er teknisk krevende.
For det andre er elektroporasjon en måte å injisere proteiner i celler via spenningsindusert membranforstyrrelse5,6,7. Denne metoden krever imidlertid igjen spesialisert, dyrt utstyr, og sjokket kan forårsake cellestress og dødelighet. Videre må celler prøves på nytt før elektroporasjon og deretter replateres, noe som begrenser tidsrammen for når celler kan undersøkes etter elektroporasjon.
For det tredje kan cellemembraner endres kjemisk for midlertidig, reversibel permeabilisering8,9. Streptolysin-O-lasting setter inn et endotoksin i cellemembraner, som danner midlertidige porer, slik at eksogene membran-ugjennomtrengelige partikler, inkludert proteiner og DNA-plasmider, kan komme inn i cellene10. Etter en 2 timers gjenoppretting reparerer omtrent halvparten av cellene disse porene og stopper internaliseringspartikler fra løsningen. Denne teknikken krever imidlertid lang gjenopprettingstid og er inkompatibel med celletyper som ikke tåler endotoksiner.
For det fjerde laster mekanisk forstyrrelse partikler inn i celler gjennom fysisk perturbasjon av cellemembranen11. Dette kan gjøres på flere måter, inkludert riper, skraping og rullende perler på toppen av celle12,13. Så tidlig som i 1987 har perler blitt brukt til å laste proteiner inn i celler mekanisk14. Mer nylig har perlelastingsteknikken blitt optimalisert og tilpasset utover proteiner for å inkludere lasting av plasmider og RNA, som beskrevet her.
Perlelasting er en enkel, billig og rask metode for lasting av protein og plasmider i tilhørende menneskelige celler. Glassperler rulles kort på toppen av celler, og forstyrrer midlertidig deres cellulære membran. Dette gjør at partikler i oppløsning kan komme inn. Siden perlelasting har lav effektivitet, er den best egnet for enkeltmolekyl- eller encellede mikroskopieksperimenter. Perlelasting kan introdusere et bredt utvalg av proteiner, inkludert fragmenterte antistoffer (Fab),15,16 rensede proteiner som scFvs,17 intrabodies,18,19eller mRNA frakkproteiner, for eksempel MS2-frakkprotein (MCP)20,21. Plasmiduttrykksvektorer kan også legges til proteinoppløsningen og perlelastet samtidig22,23,24,25.
Utover proteiner og plasmider har molekyler så store som 250 nm polystyrenperler blitt introdusert i celler via perlelasting (personlig kommunikasjon). Bead lasting er utrolig billig, koster mindre enn 0.01 USD per eksperiment i materialer og krever ingen ekstra dyrt utstyr. Kostnaden reduseres ytterligere ved å minimere mengden sonder som brukes per eksperiment fordi bare cellene i den sentrale mikrowellen med 14 mm diameter av et bildekammer er lastet. Det skal bemerkes at det begrensede lasteområdet betyr at perlelasting ikke er ideell for bulkcellelasting.
Dette manuskriptet presenterer perlelastingsprosessen, inkludert hvordan man konstruerer perlelasteapparatet og utfører et eksperiment. Den viser at proteiner, RNA og DNA kan lastes inn i ulike celletyper, og at to forskjellige, samtidig perlelastede proteiner har svært korrelerte cellulære konsentrasjoner og relativt lav varians. Også diskutert er variasjoner i protokollen basert på celletype og lasting av protein, plasmid eller RNA. Selv om perler antas å perforere og forstyrre cellemembranen, løsner perlelastingsprosessen bare et lite antall celler fra bunnen av bildekammeret når det utføres på riktig måte. Etter en kort gjenopprettingsperiode fortsetter cellene å vokse og dele seg. Denne metoden er ideell for levende cellemikroskopieksperimenter, inkludert enkeltmolekylprotein og RNA-sporing, post-translasjonell modifikasjonsdeteksjon, observasjon av dynamiske cellulære mekanismer eller subcellulær lokaliseringsovervåking15,16,22,26,27.
Perlelastingsteknikken som er beskrevet her, er en kostnadseffektiv og tidseffektiv metode for å introdusere makromolekyler og andre partikler i adherentceller. Denne allsidige prosessen kan laste protein (Figur 2A)15,16,26,27, en kombinasjon av protein og plasmider (Figur 2B,C)22,25, RNA (Figur 4C), 100 og 250 nm polystyrenperler (personlig korrespondanse), syntetiske fargestoffer39 eller kvanteprikker34,40 . Perlelasting kan også ha evnen til å laste inn andre typer membran-ugjennomtrengelige partikler. Den mest brukte applikasjonen er for lasting av antistoffer eller Fabs for å målrette endogene epitoper, for eksempel post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer), i levende celler. Mål, for eksempel PTMer, er ofte vanskelige å merke i levende celler uten etablerte PTM-spesifikke, genetisk kodede sonder41,42. Til sammenligning kan perlelasting introdusere flere typer sonder, reportere eller andre molekylære verktøy sammen i samme celle for overvåking av flere avlesninger samtidig. Vi forventer at perle lasting vil være en nyttig teknikk for lasting av en rekke makromolekyler eller partikler.
En stor fordel med bead lasting er den lave prisen: hvert eksperiment koster mindre enn 0.01 USD. Et perlelasterapparat kan enkelt gjøres ved hjelp av billige materialer som koster totalt ~ $ 150, noe som er betydelig billigere enn noen annen cellelastingsmetode. Kostnaden for et perlelasterapparat kan reduseres ytterligere til under $ 10 ved å erstatte det gjenbrukbare metallkammeret med en plast. For dette, enten bor et hull i et 35 mm kammer eller fjern glasset fra et 35 mm glassbunnkammer, og fest deretter nettet sikkert med tape. I stedet for et apparat kan perlelasting til og med utføres ved hjelp av en bredboret 1000 μL pipettespiss for å øse og drysse perler på celler, selv om denne variasjonen gjør det vanskelig å drysse en monolayer av perler på celler (trinn 4.6).
En annen fordel med bead lasting er at celler kan beholde normal generell morfologi, gjenopprette raskt, og fortsette å vokse og dele, i det minste for U2OS, RPE1 og HeLa celler studert her og for de andre cellelinjene studert andre steder (Figur 3; Figur 4A;B; Ekstra video 1; og Tabell 1)31. Under bead lasting gjennomgår celler fysisk stress og noen ganger løsner og skreller (~ 5% av cellene skreller under optimale forhold, men større celletap kan skje hvis perlebelastning utføres for kraftig eller for mange glassperler lastes på toppen av cellene, som vist i figur 3B). Imidlertid virker perlebelastede celler som forblir festet til dekslene vanligvis sunne og kan avbildes så snart som 30 minutter etter bead lasting (Figur 3A). Vi tillater vanligvis celler en 30-minutters gjenopprettingsperiode, men forventer at avbildning tidligere etter perle lasting er mulig.
En stor ulempe med denne teknikken er at cellene må være i stand til å motstå mindre fysisk stress under lasting og forbli sikkert tilhenger av dekslene. Dårlig/ikke-tilhenger cellelinjer eller celler dyrket på belagte plater (f.eks. HEK og stamceller) løsner ofte ved skånsom tapping under perlelasting. Videre har erfaring vist at primære nevroner er for følsomme for bead lasting.
Perlelasting er best egnet for enkeltcellede eller enkeltmolekyleksperimenter. Etter vår erfaring har perlelasting en omtrent 20-40% proteinbelastningseffektivitet, og ~ 20% av perlebelastede celler uttrykte også en co-loaded plasmid (Figur 2A, B). Dermed kan perlelastende plasmider være mindre effektive for proteinuttrykk enn perlelastende rensede proteiner fordi plasmider ikke bare må komme inn i celler, men også uttrykkes (som blant annet innebærer kjernefysisk import, transkripsjon og oversettelse, som hver kan redusere uttrykkseffektiviteten). Den lave effektiviteten til perlebelastet plasmiduttrykk kan omgås ved hjelp av alternative transfeksjonsprotokoller, for eksempel lipofeksjon, før perlelasting av proteiner eller sonder16,27. I tillegg kan inkubering av celler i optimale medier i 30 minutter før perlelasting hjelpe plasmiduttrykk. På grunn av lavt plasmiduttrykk har perlelasting ikke ofte blitt brukt som et alternativ til lipofeksjonsbasert transfeksjon i dette laboratoriet. Det eneste unntaket er når et renset protein, som Fab, skal co-loaded, i så fall er det ganske praktisk å bead-load proteinet og plasmid samtidig. Videre, for celler som ikke reagerer eller intolerant mot lipofeksjon, kan perlelasting gi en alternativ, om enn lav effektivitet, metode for forbigående plasmiduttrykk.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til medlemmene av Stasevich lab for utallige samtaler som bidro til å forbedre og utvikle denne protokollen. Nærmere bestemt Dr. Linda Forero og Dr. Phil Fox for råd om perle lasting av forskjellige celletyper. Vi vil gjerne takke Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato og Dr. Hiroshi Kimura for å dele deres glassperlelastingsprotokoll. Vi er veldig takknemlige til Dr. Ashok Prasad og Dr. Diego Krapf for sjenerøst å dele sine perlelastingsprotokoller for å introdusere uorganiske partikler i celler. Vi er takknemlige til Dr. Travis Sanders, Craig Marshall og Dr. Thomas Santangelo for sjenerøst å dele deres merkede RNA-reagens. ALK, MNS, CAC, GG og TJS ble støttet av National Institutes of Health (NIH) grant R35GM119728 og National Science Foundation (NSF) CAREER grant MCB-1845761, begge til TJS. CAC ble også støttet av NSF NRT-prisen DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |