Boncuk yükleme, bağlı memeli hücrelerine proteinleri, plazmidleri ve parçacıkları tanıtır. Bu hücre yükleme tekniği ucuz, hızlıdır ve hücre sağlığını önemli ölçüde etkilemez. Canlı hücre görüntüleme için en uygun olanıdır.
Birçok canlı hücre görüntüleme deneyi, hücreleri etiketlemek veya işlev görmek için eksojen parçacıklar (örneğin, peptitler, antikorlar, boncuklar) kullanır. Bununla birlikte, zarı boyunca bir hücreye protein sokmak zordur. Mevcut yöntemlerin sınırlı seçimi düşük verimlilikle mücadele eder, pahalı ve teknik olarak zorlu ekipman veya dar parametreler içindeki işlevler gerektirir. Burada, DNA, RNA ve proteinleri canlı insan hücrelerine yüklemek için nispeten basit ve uygun maliyetli bir tekniği açıklıyoruz. Boncuk yüklemesi, hücre zarında geçici bir mekanik bozulmaya neden olur ve makromoleküllerin yapışık, canlı memeli hücrelerine girmesini sağlar. Deneme başına 0,01 USD’den daha az bir fiyata, boncuk yükleme mevcut en ucuz hücre yükleme yöntemidir. Ayrıca, boncuk yüklemesi hücreleri önemli ölçüde strese sokmuyor veya canlılıklarını veya çoğalmalarını etkilemiyor. Bu makalede boncuk yükleme prosedürünün adımları, uyarlamalar, varyasyonlar ve teknik sınırlamalar açıklanmaktadır. Bu metodoloji özellikle canlı hücre görüntüleme için uygundur, ancak proteinlerin, boncukların, RNA’nın veya plazmidlerin canlı, yapışan memeli hücrelerine girmesini gerektiren diğer uygulamalar için pratik bir çözüm sağlar.
Makromoleküllerin memeli hücrelerine yüklenmesi, hücrenin plazma zarını geçmelerini sağlayan metodoloji gerektirir1. Lipozomal transfeksiyon 2 ve diethylaminoethyl-dektran transfection3 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler transfection yoluylamemelihücrelerine plazmidler sokabilir. Bununla birlikte, proteinleri veya zar geçirimsiz parçacıkları hücrelere yükleme yöntemleri daha sınırlıdır.
Çeşitli teknikler, çeşitli stratejiler kullanarak bu zor engeli atlamıştır. İlk olarak, mikroenjeksiyon parçacıkları bir mikropipetten mikroskop altında canlı hücrelere ulaştırıyor4. Tartışmasız en kontrollü ve en az invaziv yöntem olsa da, hücrelerin tek tek yüklenmesi gerektiğinden, bu teknik nispeten düşük aktarım hızına sahiptir. Ayrıca, mikroenjeksiyon özel ekipman gerektirir ve teknik olarak talep edicidir.
İkinci olarak, elektroporasyon, proteinleri voltaj kaynaklı membran bozulması 5 ,6,7yoluyla hücrelere elektro enjekteetmeninbir yoludur. Bununla birlikte, bu yöntem yine özel, pahalı ekipman gerektirir ve şok hücre stresine ve mortaliteye neden olabilir. Ayrıca, hücreler elektroporasyondan önce denenmeli ve daha sonra yeniden plakalanmalı ve hücrelerin elektroporasyon sonrası araştırılabileceği zaman dilimi sınırlandırılmalıdır.
Üçüncü olarak, hücre zarları geçici, geri dönüşümlü permeabilizasyon için kimyasal olarak değiştirilebilir8,9. Streptolysin-O yüklemesi hücre zarlarına geçici gözenekler oluşturan bir endotoksin yerleştirir ve proteinler ve DNA plazmidleri de dahil olmak üzere ekzojen membran geçirimsiz parçacıkların hücrelere girmesini sağlar10. 2 saat iyileşmeden sonra, hücrelerin yaklaşık yarısı bu gözenekleri onarır ve çözeltiden parçacıkları içselleştirmeyi durdurur. Bununla birlikte, bu teknik uzun bir iyileşme süresi gerektirir ve endotoksinleri tolere edemeyen hücre tipleriyle uyumsuzdur.
Dördüncü olarak, mekanik bozulma, hücre zarının fiziksel pertürbasyonu yoluyla parçacıkları hücrelere yükler11. Bu,12,13hücrelerinin üzerinde boncukları kaşıma, kazıma ve yuvarlama dahil olmak üzere birden fazla şekilde yapılabilir. 1987’nin başlarında, proteinleri mekanik olarak hücrelere yüklemek için boncuklar kullanılmıştır14. Daha yakın zamanda, boncuk yükleme tekniği, burada açıklandığı gibi plazmidlerin ve RNA’nın yüklenmesini içerecek şekilde proteinlerin ötesinde optimize edilmiş ve uyarlanmıştır.
Boncuk yükleme, protein ve plazmidleri yapışan insan hücrelerine yüklemek için kolay, ucuz ve hızlı bir yöntemdir. Cam boncuklar hücrelerin üzerine kısa bir süre yuvarlanır ve hücresel zarlarını geçici olarak bozar. Bu, çözeltideki parçacıkların girmesini sağlar. Boncuk yüklemesi düşük verimliliğe sahip olduğundan, tek moleküllü veya tek hücreli mikroskopi deneyleri için en uygun olanıdır. Boncuk yükleme, parçalanmış antikorlar (Fab), scFvs, 17 intrabodies, 18,19 veya mRNA kat proteinleri gibi 15,16 saflaştırılmış protein dahil olmak üzere çok çeşitli proteinleri tanıtabilir, örneğin, MS2 kat proteini (MCP)20,21. Plazmid ekspresyon vektörleri de protein çözeltisine eklenebilir ve boncuk yüklü aynı anda22 , 23,24,25.
Protein ve plazmidlerin ötesinde, 250 nm polistiren boncuk kadar büyük moleküller boncuk yüklemesi (kişisel iletişim) yoluyla hücrelere sokulmuşlardır. Boncuk yükleme inanılmaz derecede ucuzdur, malzemelerde deney başına 0,01 USD’den daha ucuzdur ve ek pahalı ekipman gerektirmemektedir. Sadece bir görüntüleme odasının merkezi 14 mm çapındaki mikro kabarmış hücreler yüklendiği için deney başına kullanılan prob miktarı en aza indirilerek maliyet daha da düşürülür. Sınırlı yükleme alanının boncuk yüklemenin toplu hücre yüklemesi için ideal olmadığı anlamına geldiği belirtilmelidir.
Bu makale, boncuk yükleme aparatının nasıl oluşturulacağı ve bir deneyin nasıl gerçekleştirilileceği de dahil olmak üzere boncuk yükleme işlemini sunar. Proteinlerin, RNA’nın ve DNA’nın çeşitli hücre tiplerine yüklenebileceğini ve iki farklı, aynı anda boncuk yüklü proteinin yüksek oranda ilişkili hücresel konsantrasyonlara ve nispeten düşük varyansa sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hücre tipine ve protein, plazmid veya RNA’nın yüklenmesine dayalı protokoldeki varyasyonlar da tartışılmaktadır. Boncukların hücre zarını delik deşip bozduğu düşünülse de, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde, boncuk yükleme işlemi görüntüleme odasının dibinden sadece az sayıda hücreyi yerinden eder. Kısa bir iyileşme döneminden sonra hücreler büyümeye ve bölünmeye devam ediyor. Bu metodoloji, tek moleküllü protein ve RNA izleme, çeviri sonrası modifikasyon tespiti, dinamik hücresel mekanizmaların gözlemlenmesi veya hücre altı lokalizasyon izleme15 , 16, 22,26,27dahil olmak üzere canlı hücreli mikroskopi deneyleri için idealdir.
Burada açıklanan boncuk yükleme tekniği, makromolekülleri ve diğer parçacıkları yapışık hücrelere sokmak için uygun maliyetli ve zaman verimli bir yöntemdir. Bu çok yönlü işlem protein yükleyebilirsiniz (Şekil 2A)15,16,26,27, protein ve plazmidlerin bir kombinasyonu ( Şekil2B,C)22,25, RNA ( Şekil4C), 100 ve 250 nm polistiren boncuklar (kişisel yazışma), sentetik boyalar39 veya kuantum noktaları34,40 . Boncuk yükleme, diğer zar geçirimsiz parçacık türlerini de yükleme yeteneğine sahip olabilir. En sık kullanılan uygulaması, çeviri sonrası değişiklikler (PTM’ler) gibi endojen epitopları hedeflemek için antikorları veya Fabs’ı canlı hücrelere yüklemek içindir. PTM’ler gibi hedeflerin, PTM’ye özgü, genetik olarak kodlanmış problar41 , 42olmadan canlı hücrelerde etiketlenerek etiketlenmeleri genellikle zordur. Buna karşılık, boncuk yükleme, aynı anda birden fazla okumayı izlemek için aynı hücreye birden fazla prob, muhabir veya diğer moleküler araçları birlikte sokabilir. Boncuk yüklemenin çeşitli makromolekülleri veya parçacıkları yüklemek için yararlı bir teknik olacağını öngörüyoruz.
Boncuk yüklemenin en büyük avantajı düşük maliyettir: her denemenin maliyeti 0,01 USD’den azdır. Boncuk yükleyici aparatı, diğer hücre yükleme yöntemlerinden önemli ölçüde daha ucuz olan toplam ~$ 150’ye mal olan ucuz malzemeler kullanılarak kolayca yapılabilir. Boncuk yükleyici aparatının maliyeti, yeniden kullanılabilir metal hazneyi plastik bir oda ile değiştirerek 10 doların altına düşürülebilir. Bunun için, 35 mm’lik bir haznede bir delik açın veya camı 35 mm’lik bir cam tabanlı hazneden çıkarın, ardından ağı bantla güvenli bir şekilde sabitleyin. Bir aparat yerine, boncuk yükleme, hücrelere boncuk kepçesi ve serpmek için geniş delikli 1000 μL pipet ucu kullanılarak bile gerçekleştirilebilir, ancak bu varyasyon hücrelere bir tek katman boncuk serpmeyi zorlaştırır (adım 4.6).
Boncuk yüklemenin bir başka yararı, hücrelerin normal genel morfolojiyi koruyabilmesi, hızla iyileşebilmesi ve en azından burada çalışılan U2OS, RPE1 ve HeLa hücreleri ve başka bir yerde çalışılan diğer hücre hatları için büyümeye ve bölünmeye devam etmesidir (Şekil 3; Şekil 4A,B; Ek Video 1; ve Tablo 1)31. Boncuk yüklemesi sırasında, hücreler fiziksel strese maruz kalmaz ve bazen yerinden çıkarır ve soyulur (~% 5 hücrelerin en uygun koşullar altında soyulur, ancak boncuk yüklemesi çok güçlü bir şekilde yapılırsa veya Şekil 3B’degösterildiği gibi hücrelerin üzerine çok fazla cam boncuk yüklenirse daha fazla hücre kaybı olabilir). Bununla birlikte, kapak kapağına bağlı kalan boncuk yüklü hücreler genellikle sağlıklı görünür ve boncuk yüklendikten 30 dakika sonra görüntülenebilir (Şekil 3A). Genellikle hücrelere 30 dakikalık bir iyileşme süresine izin veririz, ancak boncuk sonrası yüklemeden önce görüntülemenin mümkün olduğunu tahmin ederiz.
Bu tekniğin önemli bir dezavantajı, hücrelerin yükleme sırasında küçük fiziksel strese dayanabilmesi ve kapak kılıflarına güvenli bir şekilde yapışması gerektiğidir. Kaplamalı plakalarda (örneğin, HEK ve kök hücreler) yetişen zayıf/yapışmayan hücre çizgileri veya hücreler genellikle boncuk yüklemesi sırasında hafifçe dokunulduğunda ayrılır. Ayrıca, deneyimler birincil nöronların boncuk yüklemesi için çok hassas olduğunu göstermiştir.
Boncuk yükleme, tek hücreli veya tek moleküllü deneyler için en uygun olanıdır. Deneyimlerimize göre, boncuk yükleme kabaca% 20-40 protein yükleme verimliliğine sahiptir ve boncuk yüklü hücrelerin ~ % 20’si de birlikte yüklenmiş bir plazmid ifade eder (Şekil 2A, B). Bu nedenle, boncuk yükleme plazmidleri protein ekspresyonu için saflaştırılmış proteinleri yükleyen boncuktan daha az verimli olabilir, çünkü plazmidler sadece hücrelere girmekle kalmaz, aynı zamanda ifade edilmelidir (diğer şeylerin yanı sıra, her biri ifade verimliliğini düşürebilen nükleer ithalat, transkripsiyon ve çeviri içerir). Boncuk yüklü plazmid ekspresyonunun düşük verimliliği, boncuk yükleme proteinleri veya probları16,27’denönce lipofeksiyon gibi alternatif transfeksiyon protokolleri kullanılarak atlatılabilir. Ayrıca, boncuk yüklemeden önce hücrelerin 30 dakika boyunca optimal ortamda inkübe edilmesi plazmid ekspresyona yardımcı olabilir. Düşük plazmid ekspresyonu nedeniyle, boncuk yüklemesi bu laboratuvarda lipofeksiyon bazlı transfeksiyona alternatif olarak sıklıkla kullanılmamıştır. Tek istisna, Fab gibi saflaştırılmış bir proteinin birlikte yüklenmesidir, bu durumda proteini ve plazmidi aynı anda boncukla yüklemek oldukça uygundur. Ayrıca, lipofeksiyona tepkisiz veya hoşgörüsüz hücreler için boncuk yükleme, düşük verimli de olsa, geçici plazmid ekspresyonu için alternatif bir yöntem sağlayabilir.
The authors have nothing to disclose.
Stasevich laboratuvarı üyelerine, bu protokolün geliştirilmesine ve geliştirilmesine yardımcı olan sayısız konuşma için minnettarız. Özellikle, Dr. Linda Forero ve Dr. Phil Fox farklı hücre tiplerini yükleyen boncuk hakkında tavsiyeler için. Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato ve Dr. Hiroshi Kimura’ya cam boncuk yükleme protokollerini paylaştıkları için içtenlikle teşekkür ederiz. Dr. Ashok Prasad ve Dr. Diego Krapf’a, hücrelere inorganik parçacıklar sokmak için boncuk yükleme protokollerini cömertçe paylaştıkları için çok minnettarız. Dr. Travis Sanders, Craig Marshall ve Dr. Thomas Santangelo’ya etiketli RNA reaktiflerini cömertçe paylaştıkları için minnettarız. ALK, MNS, CAC, GG ve TJS, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibesi R35GM119728 ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) CAREER hibeSI MCB-1845761 tarafından desteklendi. CAC ayrıca NSF NRT ödülü DGE-1450032 tarafından da desteklendi.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |