La carga de perlas introduce proteínas, plásmidos y partículas en las células de mamíferos adherentes. Esta técnica de carga celular es económica, rápida y no afecta sustancialmente la salud celular. Es más adecuado para imágenes de células vivas.
Muchos experimentos de imágenes de células vivas utilizan partículas exógenas (por ejemplo, péptidos, anticuerpos, perlas) para etiquetar o funcionar dentro de las células. Sin embargo, la introducción de proteínas en una célula a través de su membrana es difícil. La selección limitada de métodos actuales lucha con la baja eficiencia, requiere equipos costosos y técnicamente exigentes, o funciones dentro de parámetros estrechos. Aquí, describimos una técnica relativamente simple y rentable para cargar ADN, ARN y proteínas en células humanas vivas. La carga de perlas induce una interrupción mecánica temporal de la membrana celular, permitiendo que las macromoléculas entren en células de mamíferos vivas adherentes. A menos de 0.01 USD por experimento, la carga de cuentas es el método de carga celular menos costoso disponible. Además, la carga de perlas no estresa sustancialmente las células ni afecta su viabilidad o proliferación. Este manuscrito describe los pasos del procedimiento de carga de cuentas, adaptaciones, variaciones y limitaciones técnicas. Esta metodología es especialmente adecuada para la obtención de imágenes de células vivas, pero proporciona una solución práctica para otras aplicaciones que requieren la introducción de proteínas, perlas, ARN o plásmidos en células de mamíferos vivas y adherentes.
La carga de macromoléculas en células de mamíferos requiere una metodología que les permita cruzar la membrana plasmática de la célula1. Varios métodos pueden introducir plásmidos en las células de mamíferos a través de la transfección, incluida la transfección liposomal2 y la transfección dietilaminoetil-dextrano3. Sin embargo, los métodos para cargar proteínas o partículas impermeables a la membrana en las células son más limitados.
Varias técnicas han evitado este difícil obstáculo utilizando varias estrategias. En primer lugar, la microinyección entrega partículas a través de una micropipeta a las células vivas bajo un microscopio4. Si bien podría decirse que es el método más controlado y menos invasivo, esta técnica tiene un rendimiento relativamente bajo porque las células deben cargarse una por una. Además, la microinyección requiere equipos especializados y es técnicamente exigente.
En segundo lugar, la electroporación es una forma de electroinyectar proteínas en las células a través de la interrupción de la membrana inducida por voltaje5,6,7. Sin embargo, este método nuevamente requiere equipos especializados y costosos, y el choque puede causar estrés celular y mortalidad. Además, las células deben ser tripsinizadas antes de la electroporación y posteriormente replanteadas, lo que limita el período de tiempo en el que las células pueden ser investigadas después de la electroporación.
En tercer lugar, las membranas celulares pueden modificarse químicamente para la permeabilización temporal y reversible8,9. La carga de estreptolysin-O inserta una endotoxina en las membranas celulares, que forma poros temporales, permitiendo que las partículas exógenas impermeables a la membrana, incluidas las proteínas y los plásmidos de ADN, entren en las células10. Después de una recuperación de 2 h, aproximadamente la mitad de las células reparan estos poros y detienen la internalización de partículas de la solución. Sin embargo, esta técnica requiere un largo tiempo de recuperación y es incompatible con los tipos de células que no pueden tolerar las endotoxinas.
Cuarto, la interrupción mecánica carga partículas en las células a través de la perturbación física de la membrana celular11. Esto se puede hacer de múltiples maneras, incluyendo rascar, raspar y enrollar cuentas sobre las celdas12,13. Ya en 1987, las perlas se han utilizado para cargar proteínas en las células mecánicamente14. Más recientemente, la técnica de carga de perlas se ha optimizado y adaptado más allá de las proteínas para incluir la carga de plásmidos y ARN, como se describe aquí.
La carga de perlas es un método fácil, económico y rápido para cargar proteínas y plásmidos en células humanas adherentes. Las perlas de vidrio se enrollan brevemente sobre las células, interrumpiendo temporalmente su membrana celular. Esto permite que entren partículas en solución. Como la carga de perlas tiene una baja eficiencia, es más adecuada para experimentos de microscopía de una sola molécula o de una sola célula. La carga de perlas puede introducir una amplia variedad de proteínas, incluidos anticuerpos fragmentados (Fab),15,16 proteínas purificadas como scFvs,17 intracuerpos,18,19o proteínas de recubrimiento de ARNm, por ejemplo, proteína de capa MS2 (MCP)20,21. Los vectores de expresión de plásmidos también se pueden agregar a la solución de proteínas y cargar perlas simultáneamente22,23,24,25.
Más allá de las proteínas y los plásmidos, moléculas tan grandes como perlas de poliestireno de 250 nm se han introducido en las células a través de la carga de perlas (comunicación personal). La carga de cuentas es increíblemente barata, cuesta menos de 0.01 USD por experimento en materiales y no requiere equipo costoso adicional. El costo se reduce aún más al minimizar la cantidad de sondas utilizadas por experimento porque solo se cargan las células en el micronúculo central de 14 mm de diámetro de una cámara de imágenes. Cabe señalar que el área de carga limitada significa que la carga de perlas no es ideal para la carga de celdas a granel.
Este manuscrito presenta el proceso de carga de cuentas, incluyendo cómo construir el aparato de carga de cuentas y realizar un experimento. Muestra que las proteínas, el ARN y el ADN se pueden cargar en varios tipos de células y que dos proteínas diferentes, cargadas simultáneamente con cuentas, tienen concentraciones celulares altamente correlacionadas y una varianza relativamente baja. También se discuten las variaciones en el protocolo basadas en el tipo de célula y la carga de proteínas, plásmidos o ARN. Aunque se cree que las perlas perforan e interrumpen la membrana celular, cuando se realizan adecuadamente, el proceso de carga de perlas desaloja solo un pequeño número de células de la parte inferior de la cámara de imágenes. Después de un corto período de recuperación, las células continúan creciendo y dividiéndose. Esta metodología es ideal para experimentos de microscopía de células vivas, incluido el seguimiento de proteínas y ARN de molécula única, la detección de modificaciones postraducción, la observación de mecanismos celulares dinámicos o el monitoreo de localización subcelular15,16,22,26,27.
La técnica de carga de perlas descrita aquí es un método rentable y eficiente en el tiempo para introducir macromoléculas y otras partículas en las células adherentes. Este versátil proceso puede cargar proteínas(Figura 2A)15,16,26,27,una combinación de proteínas y plásmidos(Figura 2B,C)22,25,ARN(Figura 4C),perlas de poliestireno de 100 y 250 nm (correspondencia personal), colorantes sintéticos39 o puntos cuánticos34,40 . La carga de perlas también puede tener la capacidad de cargar otros tipos de partículas impermeables a la membrana. Su aplicación más utilizada es para cargar anticuerpos o Fabs para dirigirse a epítopos endógenos, como las modificaciones post-tradesales (PTM), en células vivas. Los objetivos, como los PTM, a menudo son difíciles de etiquetar en células vivas sin sondas establecidas específicas de PTM, codificadas genéticamente41,42. Por el contrario, la carga de perlas puede introducir múltiples tipos de sondas, reporteros u otras herramientas moleculares juntas en la misma celda para monitorear múltiples lecturas simultáneamente. Anticipamos que la carga de cuentas será una técnica útil para cargar una variedad de macromoléculas o partículas.
Una gran ventaja de la carga de cuentas es el bajo costo: cada experimento cuesta menos de 0.01 USD. Un aparato cargador de cuentas se puede hacer fácilmente utilizando materiales baratos que cuestan en total ~ $ 150, que es significativamente menos costoso que cualquier otro método de carga de celdas. El costo de un aparato cargador de cuentas se puede reducir aún más a menos de $ 10 reemplazando la cámara de metal reutilizable por una de plástico. Para esto, perfore un orificio en una cámara de 35 mm o retire el vidrio de una cámara con fondo de vidrio de 35 mm, luego sujete de forma segura la malla en su lugar con cinta adhesiva. En lugar de un aparato, la carga de perlas incluso se puede realizar utilizando una punta de pipeta de 1000 μL de diámetro ancho para recoger y rociar cuentas sobre las células, aunque esta variación dificulta la espolvoreo de una monocapa de perlas sobre las células (paso 4.6).
Otro beneficio de la carga de perlas es que las células pueden retener la morfología general normal, recuperarse rápidamente y continuar creciendo y dividiéndose, al menos para las células U2OS, RPE1 y HeLa estudiadas aquí y para las otras líneas celulares estudiadas en otros lugares (Figura 3; Figura 4A,B; Video suplementario 1; y Cuadro 1)31. Durante la carga de perlas, las células sufren estrés físico y, a veces, se desprenden y pelan (~ 5% de las células se pelan en condiciones óptimas, pero puede ocurrir una mayor pérdida de células si la carga de cuentas se realiza con demasiada fuerza o se cargan demasiadas perlas de vidrio sobre las células, como se muestra en la Figura 3B). Sin embargo, las células cargadas de perlas que permanecen unidas al la cubierta generalmente parecen sanas y se pueden obtener imágenes tan pronto como 30 minutos después de la carga de la cuenta(Figura 3A). Por lo general, permitimos a las células un período de recuperación de 30 minutos, pero anticipamos que es factible obtener imágenes antes después de la carga de perlas.
Un inconveniente importante de esta técnica es que las células deben ser capaces de soportar un estrés físico menor durante la carga y permanecer firmemente adheridas a la cubierta. Las líneas celulares pobres / no adherentes o las células cultivadas en placas recubiertas (por ejemplo, HEK y células madre) a menudo se desprenden al golpear suavemente durante la carga de perlas. Además, la experiencia ha demostrado que las neuronas primarias son demasiado sensibles para la carga de perlas.
La carga de perlas es la más adecuada para experimentos de una sola célula o de una sola molécula. En nuestra experiencia, la carga de perlas tiene una eficiencia de carga de proteínas de aproximadamente el 20-40%, y ~ 20% de las células cargadas de perlas también expresaron un plásmido cocargado(Figura 2A,B). Por lo tanto, los plásmidos de carga de perlas pueden ser menos eficientes para la expresión de proteínas que las proteínas purificadas de carga de perlas porque los plásmidos no solo deben ingresar a las células sino también expresarse (lo que implica, entre otras cosas, la importación nuclear, la transcripción y la traducción, cada una de las cuales puede disminuir la eficiencia de expresión). La baja eficiencia de la expresión de plásmidos cargados de perlas puede eludirse mediante el uso de protocolos alternativos de transfección, como la lipofección, antes de las proteínas de carga de perlas o sondas16,27. Además, la incubación de células en medios óptimos durante 30 minutos antes de la carga de perlas puede ayudar a la expresión de plásmidos. Debido a la baja expresión de plásmidos, la carga de perlas no se ha utilizado a menudo como una alternativa a la transfección basada en la lipofección en este laboratorio. La única excepción es cuando una proteína purificada, como Fab, se va a cargar de forma co-cargada, en cuyo caso es bastante conveniente cargar la proteína y el plásmido al mismo tiempo. Además, para las células que no responden o son intolerantes a la lipofección, la carga de perlas puede proporcionar un método alternativo, aunque de baja eficiencia, para la expresión transitoria de plásmidos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del laboratorio Stasevich por las innumerables conversaciones que ayudaron a mejorar y desarrollar este protocolo. Específicamente, la Dra. Linda Forero y el Dr. Phil Fox para obtener consejos sobre la carga de cuentas en diferentes tipos de células. Yoko Hayashi-Takanaka, el Dr. Yuko Sato y el Dr. Hiroshi Kimura por compartir su protocolo de carga de cuentas de vidrio. Estamos muy agradecidos al Dr. Ashok Prasad y al Dr. Diego Krapf por compartir generosamente sus protocolos de carga de cuentas para introducir partículas inorgánicas en las células. Estamos agradecidos con el Dr. Travis Sanders, Craig Marshall y el Dr. Thomas Santangelo por compartir generosamente su reactivo de ARN etiquetado. ALK, MNS, CAC, GG y TJS fueron apoyados por la subvención R35GM119728 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la subvención CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) MCB-1845761, ambas a TJS. CAC también fue apoyado por el premio NSF NRT DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |