Perlebelastning introducerer proteiner, plasmider og partikler i klæbende pattedyrceller. Denne cellebelastningsteknik er billig, hurtig og påvirker ikke cellesundheden væsentligt. Det er bedst egnet til live-celle billeddannelse.
Mange live-celle imaging eksperimenter bruger udefrakommende partikler (f.eks peptider, antistoffer, perler) til at mærke eller fungere i celler. Det er imidlertid vanskeligt at introducere proteiner i en celle på tværs af membranen. Det begrænsede udvalg af nuværende metoder kæmper med lav effektivitet, kræver dyrt og teknisk krævende udstyr eller funktioner inden for snævre parametre. Her beskriver vi en relativt enkel og omkostningseffektiv teknik til at indlæse DNA, RNA og proteiner i levende menneskelige celler. Perlebelastning fremkalder en midlertidig mekanisk forstyrrelse af cellemembranen, så makromolekyler kan komme ind i klæbende, levende pattedyrceller. På mindre end 0,01 USD per eksperiment, perle lastning er den billigste celleindlæsning metode til rådighed. Desuden stresser perlebelastning ikke i væsentlig grad celler eller påvirker deres levedygtighed eller spredning. Dette manuskript beskriver trinene i perleindlæsningsproceduren, tilpasninger, variationer og tekniske begrænsninger. Denne metode er specielt velegnet til levende cellebilleddannelse, men giver en praktisk løsning til andre applikationer, der kræver indførelse af proteiner, perler, RNA eller plasmider i levende, klæbende pattedyrceller.
Indlæsning af makromolekyler i pattedyrsceller kræver en metode, der gør det muligt for dem at krydse cellens plasmamembran1. Flere metoder kan indføre plasmider i pattedyrsceller gennem transfection, herunder fedtsomale transfection2 og diethylaminoethyl-dextran transfection3. Metoder til indlæsning af proteiner eller membran-uigennemtrængelige partikler i celler er dog mere begrænsede.
Flere teknikker har omgået denne vanskelige hurdle ved hjælp af forskellige strategier. For det første leverer mikroinjektion partikler gennem en mikropipette i levende celler under et mikroskop4. Mens velsagtens den mest kontrollerede og mindst invasive metode, denne teknik er relativt lav-throughput, fordi celler skal indlæses en efter en. Desuden kræver mikroinjection specialiseret udstyr og er teknisk krævende.
For det andet er elektroporation en måde at elektroinje proteiner i celler via spændingsinduceret membranforstyrrelse5,6,7. Men denne metode kræver igen specialiseret, dyrt udstyr, og chokket kan forårsage cellestress og dødelighed. Desuden skal cellerne trypsiniseres før elektroporering og efterfølgende omlægges, hvilket begrænser den tidsramme, hvor celler kan undersøges efter elektroporation.
For det tredje kan cellemembraner kemisk modificeres til midlertidig, reversibel permeabilisering8,9. Streptolysin-O-belastning indsætter en endotoksin i cellemembraner, som danner midlertidige porer, hvilket gør det muligt for udefrakommende membran-uigennemtrængelige partikler, herunder proteiner og DNA-plasmider, at komme ind i cellerne10. Efter en 2 timers genopretning reparerer omkring halvdelen af cellerne disse porer og stopper internalisering af partikler fra opløsningen. Denne teknik kræver dog lang restitutionstid og er uforenelig med celletyper, der ikke kan tolerere endotoksiner.
For det fjerde indlæser mekaniske forstyrrelser partikler i celler gennem fysisk forstyrrelse af cellemembranen11. Dette kan gøres på flere måder, herunder ridser, skrabning og rullende perler oven på cellerne12,13. Så tidligt som i 1987, perler er blevet brugt til at indlæse proteiner i celler mekanisk14. For nylig er perlebelastningsteknikken blevet optimeret og tilpasset ud over proteiner til at omfatte lastning af plasmid og RNA, som beskrevet her.
Perlebelastning er en nem, billig og hurtig metode til at indlæse protein og plasmid i klæbende menneskelige celler. Glasperler rulles kortvarigt oven på celler, der midlertidigt forstyrrer deres cellulære membran. Dette gør det muligt for partikler i opløsning at komme ind. Da perlebelastning har lav effektivitet, er den bedst egnet til enkeltmolekyle- eller enkeltcellede mikroskopiforsøg. Perlebelastning kan introducere en bred vifte af proteiner, herunder fragmenterede antistoffer (Fab),15,16 rensede proteiner som scFvs,17 intrabodies,18,19eller mRNA-pelsproteiner, f.eks. MS2-frakkeprotein (MCP)20,21. Plasmid-udtryksvektorer kan også tilsættes proteinopløsningen og perleindlæses samtidigt22,23,24,25.
Ud over proteiner og plasmider er molekyler så store som 250 nm polystyrenperler blevet introduceret i celler via perlebelastning (personlig kommunikation). Perlebelastning er utroligt billig, koster mindre end 0,01 USD pr. eksperiment i materialer og kræver ikke yderligere dyrt udstyr. Omkostningerne reduceres yderligere ved at minimere mængden af sonder, der anvendes pr. eksperiment, fordi kun cellerne i den centrale mikrowell med en billedbehandlingskammers centrale mikrorum med en diameter er indlæst. Det skal bemærkes, at det begrænsede lasteområde betyder, at perlebelastning ikke er ideel til bulkcellebelastning.
Dette manuskript præsenterer perlebelastningsprocessen, herunder hvordan man konstruerer perleindlæsningsapparatet og udfører et eksperiment. Det viser, at proteiner, RNA, og DNA kan indlæses i forskellige celletyper, og at to forskellige, samtidig perle-loaded proteiner har meget korrelerede cellulære koncentrationer og relativt lav varians. Også diskuteret er variationer i protokollen baseret på celletype og belastning af protein, plasmid, eller RNA. Selvom perler menes at perforere og forstyrre cellemembranen, fjerner perlebelastningsprocessen kun et lille antal celler fra bunden af billedkammeret, når den udføres korrekt. Efter en kort restitutionsperiode fortsætter cellerne med at vokse og opdele. Denne metode er ideel til live-celle mikroskopi eksperimenter, herunder enkelt-molekyle protein og RNA tracking, post-translationel modifikation detektion, observation af dynamiske cellulære mekanismer, eller subcellulære lokalisering overvågning15,16,22,26,27.
Perlebelastningsteknikken, der er beskrevet her, er en omkostningseffektiv og tidseffektiv metode til at introducere makromolekyler og andre partikler i klæbende celler. Denne alsidige proces kan indlæse protein (Figur 2A)15,16,26,27, en kombination af protein og plasmider ( Figur2B,C)22,25, RNA ( Figur4C), 100 og 250 nm polystyrenperler (personlig korrespondance), syntetiske farvestoffer39 eller kvanteprikker34,40 . Perlebelastning kan også have mulighed for at indlæse andre typer membranindtrængelige partikler. Dens hyppigst anvendte anvendelse er til lastning antistoffer eller Fabs at målrette endogene epitoper, såsom post-translationelle ændringer (PTMs), i levende celler. Mål, såsom PTM’er, er ofte vanskelige at mærke i levende celler uden etablerede PTM-specifikke, genetisk kodede sonder41,42. I modsætning hertil kan perlebelastning introducere flere typer sonder, journalister eller andre molekylære værktøjer sammen i den samme celle til overvågning af flere udlæsninger samtidigt. Vi forventer, at perlebelastning vil være en nyttig teknik til lastning af en række makromolekyler eller partikler.
En stor fordel ved perlebelastning er de lave omkostninger: Hvert eksperiment koster mindre end 0,01 USD. En perle loader apparat kan gøres nemt ved hjælp af billige materialer koster i alt ~ $ 150, hvilket er betydeligt billigere end nogen anden celle-loading metode. Omkostningerne ved en perle læsseapparat kan yderligere reduceres til under $ 10 ved at erstatte genanvendelige metalkammer med en plastik en. Til dette skal du enten bore et hul i et 35 mm kammer eller fjerne glasset fra et 35 mm glasbundet kammer og derefter fastgøre masken sikkert med tape. I stedet for et apparat kan perlebelastning endda udføres ved hjælp af en bred boring 1000 μL pipettespids til at scoop og drysse perler på celler, selvom denne variation gør det vanskeligt at drysse en monolag af perler på celler (trin 4.6).
En anden fordel ved perlebelastning er, at cellerne kan bevare normal samlet morfologi, genoprette hurtigt og fortsætte med at vokse og opdele, i det mindste for U2OS-, RPE1- og HeLa-cellerne, der studeres her og for de andre cellelinjer, der studeres andre steder (figur 3; Figur 4A, B; Supplerende video 1; og tabel 1)31. Under perlebelastning gennemgår cellerne fysisk stress og løsner undertiden og skræller (~ 5% af cellerne skræl under optimale forhold, men større celletab kan ske, hvis perlebelastning udføres for kraftigt, eller for mange glasperler indlæses oven på cellerne, som afbildet i figur 3B). Perleinstallerede celler, der forbliver fastgjort til dækslerne, ser dog normalt sunde ud og kan afbildes så snart som 30 min efter perlebelastning (Figur 3A). Vi tillader generelt celler en 30-minutters restitutionsperiode, men forventer, at billeddannelse før post-perlebelastning er mulig.
En stor ulempe ved denne teknik er, at cellerne skal være i stand til at modstå mindre fysisk stress under belastning og forblive sikkert klæbende til coverlip. Dårligt/ikke-klæbende cellelinjer eller celler, der dyrkes på coatede plader (f.eks. HEK og stamceller), løsnes ofte ved blid aflytning under perlebelastning. Desuden har erfaringen vist, at primære neuroner er for følsomme til perlebelastning.
Perlebelastning er bedst egnet til enkeltcellede eller enkeltmolekyleforsøg. Det er vores erfaring, perle lastning har en ca 20-40% protein lastning effektivitet, og ~ 20% af perle-loaded celler også udtrykt en co-loaded plasmid (Figur 2A,B). Perlebelastningsplasmider kan således være mindre effektive til proteinudtryk end perlebelastning af rensede proteiner, fordi plasmider ikke kun skal komme ind i celler, men også udtrykkes (hvilket blandt andet involverer nuklear import, transskription og oversættelse, som hver især kan sænke udtrykseffektiviteten). Den lave effektivitet af perle-loaded plasmid udtryk kan omgås ved hjælp af alternative transfection protokoller, såsom fedtsugning, før perle lastning proteiner eller sonder16,27. Derudover kan inkubation af celler i optimale medier i 30 minutter før perlebelastning hjælpe plasmidudtryk. På grund af lav plasmid udtryk, perle lastning har ikke ofte været brugt som et alternativ til lipofection-baseret transfection i dette laboratorium. Den eneste undtagelse er, når et renset protein, såsom Fab, skal co-loaded, i hvilket tilfælde det er ganske bekvemt at perle-belastning protein og plasmid på samme tid. Desuden kan perlebelastning for celler, der ikke reagerer eller er intolerante over for fedtsugning, give en alternativ, om end laveffektiv, metode til forbigående plasmidudtryk.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for medlemmerne af Stasevich laboratoriet for utallige samtaler, der hjalp med at forbedre og udvikle denne protokol. Specifikt, Dr. Linda Forero og Dr. Phil Fox for rådgivning om perle lastning forskellige celletyper. Vi vil gerne oprigtigt takke Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato og Dr. Hiroshi Kimura for at dele deres glas perle lastning protokol. Vi er meget taknemmelige for Dr. Ashok Prasad og Dr. Diego Krapf for generøst at dele deres perle lastning protokoller for at indføre uorganiske partikler i celler. Vi er taknemmelige for Dr. Travis Sanders, Craig Marshall, og Dr. Thomas Santangelo for generøst at dele deres mærket RNA reagens. ALK, MNS, CAC, GG og TJS blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R35GM119728 og National Science Foundation (NSF) CAREER tilskud MCB-1845761, begge til TJS. CAC blev også støttet af NSF NRT-prisen DGE-1450032.
10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |