Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.
Abstract
Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen und werden routinemäßig mit empirischen Antibiotika behandelt. Aufgrund der zunehmenden mikrobiellen Resistenz ist die Wirksamkeit der am häufigsten verwendeten Antibiotika jedoch zurückgegangen. Um alternative Behandlungsmöglichkeiten zu finden, besteht ein großer Bedarf an einem besseren Verständnis der HWI-Pathogenese und der Mechanismen, die die UTI-Anfälligkeit bestimmen. Um dies im Tiermodell zu untersuchen, ist ein reproduzierbarer, nicht-invasiver Assay zur Untersuchung des Verlaufs der Harnwegsinfektion unabdingbar.
Der Goldstandard für die Aufzählung der Bakterienbelastung ist seit Jahren die Bestimmung von Colony Forming Units (CFU) für ein bestimmtes Probenvolumen. Diese Technik erfordert postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen, die die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränken. Als Alternative gewinnt die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) an Popularität, um die Bakterienbelastung zu bestimmen. Die Markierung von Krankheitserregern mit einem Lux-Operon ermöglicht den sensitiven Nachweis und die Quantifizierung auf nicht-invasive Weise und ermöglicht so eine longitudinale Nachsorge. Bisher ist die Einführung von BLI in der Harnwegsinfektionsforschung begrenzt.
Dieses Manuskript beschreibt die praktische Implementierung von BLI in einem Maus-Harnwegsinfektionsmodell. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Kultivierung von Bakterien, die intravesikale Instillation und die Bildgebung bereitgestellt. Die in vivo Korrelation mit CFU wird untersucht und ein Proof-of-Concept wird durch den Vergleich der Keimbelastung von unbehandelten infizierten Tieren mit antibiotikabehandelten Tieren erbracht. Darüber hinaus werden die Vorteile, Einschränkungen und Überlegungen speziell für die Implementierung von BLI in einem in vivo UTI-Modell diskutiert. Die Implementierung von BLI im UTI-Forschungsfeld wird die Erforschung der Pathogenese von UTI und die Entdeckung neuer Wege zur Prävention und Behandlung von UTI erheblich erleichtern.
Introduction
Harnwegsinfektionen (UTI) gehören zu den häufigsten bakteriellen Infektionen beim Menschen. Fast die Hälfte aller Frauen wird im Laufe ihres Lebens eine symptomatische Harnwegsinfektion erfahren1. Infektionen, die auf die Blase beschränkt sind, können zu Harnwegssymptomen wie Zunahme der Harnfrequenz, Dringlichkeit, Hämaturie, Inkontinenz und Schmerzen führen. Wenn die Infektion in die oberen Harnwege aufsteigt, entwickeln die Patienten pyelonephritis mit Unwohlsein, Fieber, Schüttelfrost und Rückenschmerzen. Darüber hinaus leiden bis zu 20% der Patienten mit Harnwegsinfektionen an wiederkehrenden Infektionen, was zu einer dramatischen Abnahme der Antibiotikaempfindlichkeit führt2,3,4. In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an neuartigen Therapien zur Behandlung und Prävention von rezidivierenden Harnwegsinfektionen. Trotz eines besseren Verständnisses der angeborenen und adaptiven Immunität der unteren Harnwege und der bakteriellen Virulenzfaktoren, die für die Invasion und Kolonisierung notwendig sind, wurden keine radikalen Veränderungen im Behandlungsregime auf die tägliche urologische Praxis übertragen2. Um die Pathogenese und Suszeptibilität von Harnwegsinfektionen in vivozu untersuchen, ist ein reproduzierbarer und nicht-invasiver Assay unerlässlich.
Mehrere tierische UTI-Modelle wurden beschrieben, die von Nematoden bis zu Primaten reichen, aber das murine Modell wird überwiegend verwendet5,6. Dieses Modell besteht aus der transurethralen Katheterisierung von (weiblichen) Mäusen und der anschließenden Instillation einer bakteriellen Suspension, am häufigsten uropathogenen Escherichia coli (UPEC), direkt in das Blasenlumen7. Nach der Impfung wurde die Keimbelastung traditionell durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) quantifiziert. Diese Technik erfordert das Opfern von Tieren, um postmortale Organhomogenate und serielle Verdünnungen zu erhalten, was die Datenausgabe und Reproduzierbarkeit einschränkt. Darüber hinaus ist eine longitudinale Nachsorge der Keimbelastung bei einzelnen Tieren mit dieser Technik nicht möglich.
1995 schlugen Contag etal. die Verwendung von biolumineszenzmarkierten Krankheitserregern zur Überwachung von Krankheitsprozessen beilebendenTieren vor 8,9. Seitdem wurde die Biolumineszenzbildgebung (BLI) auf zahlreiche Infektionsmodelle wie Meningitis, Endokarditis, Osteomyelitis, Haut- und Weichteilinfektionen usw. angewendet.10,11,12. Im murinen UTI-Modell kann eine UPEC-Dehnung mit dem kompletten Lux-Operon (luxCDABE) von Photorhabdus luminescens verwendet werden13. Eine enzymatische Reaktion wird durch die bakterielle Luciferase katalysiert, die von der Oxidation langkettiger Aldehyde abhängig ist, die mit reduziertem Flavinmononukleotid in Gegenwart von Sauerstoff reagieren und das oxidierte Flavin, eine langkettige Fettsäure und Licht12ergeben. Das Lux-Operon kodiert für die Luciferase und andere Enzyme, die für die Synthese der Substrate benötigt werden. Daher emittieren alle metabolisch aktiven Bakterien kontinuierlich blaugrünes (490 nm) Licht, ohne dass die Injektion eines exogenen Substrats erforderlich ist12. Photonen, die von lux-markiertenBakterien emittiert werden, können mit hochempfindlichen, gekühlten CCD-Kameras (Charge-Coupled Device) erfasst werden.
Die Verwendung von biolumineszierenden Bakterien in einem Modell für Harnwegsinfektionen ermöglicht die longitudinale, nicht-invasive Quantifizierung der Bakterienbelastung, wobei die Notwendigkeit entfällt, Tiere zu festen Zeitpunkten während der Nachbeobachtung für die CFU-Bestimmung zu opfern. Trotz der breiten Palette von Möglichkeiten, die Beweise für die Robustheit dieser BLI-Technik in anderen Bereichen und ihre Vorteile gegenüber klassischen Modellen der Harnwegsinfektion sammeln, wurde sie in der HWI-Forschung nicht weit verbreitet. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung und hebt die Vorteile von BLI für die gesamte zukünftige UTI-Forschung hervor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorteile von BLI gegenüber CFU-Zählungen
Längsschnittdaten
Ein großer Nachteil der traditionellen Methode zur Zählung der KBE zur Quantifizierung der mikrobiellen Belastung ist die Anforderung von postmortalen Organhomogenaten, die nur einen Querschnittsdatenpunkt pro Tier liefern. Umgekehrt ermöglicht BLI eine nicht-invasive Längsschnitt-Nachsorge infizierter Tiere. Die Tiere können 2 bis 3 Mal am Tag abgebildet werden und geben einen detaillierten Einblick in die Kinetik der Infe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Forschungsstiftung – Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), der Forschungsrat der KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. und W.E.) und das VIB (an T.V.). W.E. ist leitender klinischer Forscher der Forschungsstiftung – Flandern (FWO Vlaanderen). Die Sorte UTI89-lux war ein großzügiges Geschenk aus dem Labor von Prof. Seed13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
Riferimenti
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
