요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료
Summary
이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.
Abstract
요로 감염 (UTI) 인간에서 가장 일반적인 세균 성 감염 중 순위 와 정기적으로 경험적 항생제로 치료. 그러나, 미생물 저항증가 때문에, 가장 많이 사용된 항생제의 효험은 쇠퇴했습니다. 대체 치료 옵션을 찾기 위해, UTI 병인및 UTI 감수성을 결정하는 기계장치의 더 나은 이해를 위한 중대한 필요가 있습니다. 동물 모델에서 이를 조사하기 위해, UTI의 과정을 연구하는 재현 가능한 비침습적 분석은 필수적입니다.
수년 동안, 세균 부하의 열거에 대한 금 본위제는 특정 시료 부피에 대한 콜로니 성형 유닛(CFU)의 결정이었다. 이 기술은 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 요구하여 데이터 출력과 재현성을 제한합니다. 대안으로, 생물 발광 화상 진찰 (BLI)는 세균 부하를 결정하기 위하여 인기를 얻고 있습니다. 럭스 오페론을 가진 병원체를 라벨링하면 비침습적 방식으로 민감한 검출 및 정량화를 허용하여 세로 후속 조치를 가능하게 합니다. 지금까지, UTI 연구에서 BLI의 채택은 제한 남아.
이 원고는 마우스 요로 감염 모델에서 BLI의 실제 구현을 설명합니다. 여기에서, 박테리아를 배양하기위한 단계별 가이드, 내장 주입 및 이미징이 제공됩니다. CFU와의 생체 내 상관 관계를 검사하고 항생제 치료 동물과 치료되지 않은 감염된 동물의 세균 부하를 비교하여 개념 증명이 제공됩니다. 또한 생체 내 UTI 모델에서 BLI 구현과 관련된 장점, 제한 및 고려 사항에 대해 논의합니다. UTI 연구 분야에서 BLI의 구현은 크게 UTI의 병인에 대한 연구와 요로 감염을 예방하고 치료하는 새로운 방법의 발견을 용이하게 할 것입니다.
Introduction
요로 감염 (UTI)은 인간에서 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다. 모든 여성의 거의 절반은 일생 동안 증상 UTI를 경험하게 될 것입니다1. 방광에 국한된 감염은 오줌 주파수, 긴급성, 혈뇨증, 요실금 및 고통의 증가와 같은 오줌 현상을 초래할 수 있습니다. 감염이 위요로 올라갈 때, 환자는 불쾌감, 발열, 오한 및 허리 통증으로 열성염을 일으킵니다. 더욱이, UTI를 가진 환자의 최대 20%는 항생감2,3,4의극적인 감소의 결과로 재발성 감염 때문에 손해를 입습니다. 최근 몇 년 동안, 재발성 UTI의 치료 및 예방을위한 새로운 치료에 대한 관심이 증가하고있다. 하부 요로의 선천적이고 적응력있는 면역력과 침략과 식민지화에 필요한 세균성 독성 요인에 대한 더 나은 이해에도 불구하고, 치료 정권의 급진적인 변화는 매일 비뇨기과 연습2로번역되지 않았다. 유로병증과 생체내감수성을 연구하기 위해서는 재현 가능한 비침습적 분석이 필수적입니다.
여러 동물 UTI 모델은 선충에서 영장류에 이르기까지 설명되었지만, 뮤린 모델은 주로5,6을사용한다. 본 모델은 (여성) 마우스의 경도 카테터삽입과 세균현탁액의 후속 주입, 가장 일반적으로 비뇨기과 성 대장균(UPEC), 방광 루멘7로직접 구성된다. 접종 후, 세균부하는 전통적으로 식민지 형성 단위(CFU)를 결정함으로써 정량화되었다. 이 기술은 동물에게 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 얻기 위해 희생하여 데이터 출력과 재현성을 제한해야 합니다. 더욱이, 개별 동물에서 세균 부하의 세로 후속은이 기술을 사용하여 불가능합니다.
1995년, 전염병 외는 살아있는 동물의 질병 과정을 모니터링하기 위해 생물발광성 태그병원균의 사용을제안8, 9. 그 이후, 생물발광 이미징(BLI)은 뇌막염, 내막염, 골수염, 피부 및 연조직 감염 등과 같은 수많은 감염 모델에 적용되어10,11,12. 뮤린 UTI 모델에서는, Photorhabdus 발광으로부터의 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 사용한 UPEC 균주를 사용할 수 있다13. 효소 반응은 산소의 존재에 감소 된 플라빈 모노 뉴클레오티드와 반응 긴 사슬 알데히드의 산화에 의존하는 세균 성 루시포라에 의해 촉매, 산화 플라빈을 산출, 긴 사슬 지방산과 빛12. 럭스 오페론은 기판의 합성에 필요한 루시파라제 및 기타 효소에 대한 인코딩. 따라서, 모든 대사 활성 박테리아는 외인성기판(12)의주사를 필요로 하지 않고 지속적으로 청록색(490nm) 빛을 방출한다. 럭스태그 박테리아에 의해 방출 광자를 캡처할 수 있는 매우 민감한, 냉각 충전 결합 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여.
UTI모델에서 생물발광성 박테리아를 사용하면 세균 부하의 세로, 비침습적 정량화를 허용하며, CFU 결정에 대한 후속 조치 중 고정 된 시간 지점에서 동물을 희생할 필요성을 생략합니다. 가능성의 넓은 범위에도 불구하고, 다른 분야에서이 BLI 기술의 견고성과 UTI의 고전적인 모델에 비해 장점에 대한 증거를 축적, 그것은 널리 UTI 연구에서 구현되지 않았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 상세한 단계별 가이드를 제공하고 모든 미래 UTI 연구에 BLI의 장점을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFU 수에 비해 BLI의 장점
세로 데이터
미생물 부담을 정량화하기 위해 CFU를 세는 전통적인 방법의 주요 단점은 동물 당 단면 데이터 포인트만 제공하는 사후 조직 균질화의 요구 사항입니다. 반대로 BLI는 감염된 동물의 비침습적 종방향 후속 조치를 가능하게 합니다. 동물은 감염의 역학에 대한 자세한 통찰력을 제공, 하루에 2 ~ 3 번 이미지 할 수 있습니다. 또한 동일한 동?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 재단의 보조금에 의해 지원되었다 – 플랑드르 (FWO 블라안데렌; G0A6113N, KU 루벤 연구 위원회 (C1-TRPLe; T.V. 및 W.E.) 및 VIB (T.V.에). W.E.는 연구 재단의 수석 임상 연구원입니다 – 플랑드르 (FWO 블라안데렌). 변형 UTI89-럭스는 교수 의 실험실에서 관대 한 선물이었다13.
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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