Dette manuskript beskriver intravesisk administration af uropatogene bakterier med en lux operon at fremkalde en urinvejsinfektion i mus og efterfølgende langsgående in vivo analyse af bakteriebelastningen ved hjælp af bioluminescens billeddannelse.
Urinvejsinfektioner (UTI) rangerer blandt de mest almindelige bakterielle infektioner hos mennesker og behandles rutinemæssigt med empirisk antibiotika. Men på grund af stigende mikrobiel resistens, effekten af de mest anvendte antibiotika er faldet. For at finde alternative behandlingsmuligheder er der et stort behov for en bedre forståelse af UTI-patogenesen og de mekanismer, der bestemmer UTI-modtagelighed. For at undersøge dette i en dyremodel er en reproducerbar, ikke-invasiv analyse for at studere forløbet af UTI uundværlig.
I årevis har guldstandarden for optælling af bakteriebelastning været bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU) for et bestemt prøvevolumen. Denne teknik kræver post mortem organ homogenater og serielle fortyndinger, begrænse data output og reproducerbarhed. Som et alternativ, bioluminescens imaging (BLI) er stigende popularitet til at bestemme bakterielle belastning. Mærkning af patogener med en lux operon giver mulighed for følsom påvisning og kvantificering på en ikke-invasiv måde, hvilket muliggør en langsgående opfølgning. Indtil videre er vedtagelsen af BLI i UTI-forskning fortsat begrænset.
Dette manuskript beskriver den praktiske gennemførelse af BLI i en mus urinvejsinfektion model. Her findes en trinvis vejledning til dyrkning af bakterier, intravesisk instillation og billeddannelse. In vivo-korrelationen med CFU undersøges, og der tilvejebringes et proof-of-concept ved at sammenligne bakteriebelastningen af ubehandlede inficerede dyr med antibiotikabehandlede dyr. Desuden diskuteres de fordele, begrænsninger og overvejelser, der er specifikke for gennemførelsen af BLI i en in vivo UTI-model. Gennemførelsen af BLI på UTI-forskningsområdet vil i høj grad lette forskningen i patogenese af UTI og opdagelsen af nye måder at forebygge og behandle UTI på.
Urinvejsinfektioner (UTI) er blandt de mest almindelige bakterielle infektioner hos mennesker. Næsten halvdelen af alle kvinder vil opleve en symptomatisk UTI i løbet af deres levetid1. Infektioner begrænset til blæren kan give anledning til urin symptomer såsom stigning i urin frekvens, haster, hæmaturi, inkontinens, og smerte. Når infektionen stiger op til de øvre urinveje, patienter udvikler pyelonephritis, med utilpashed, feber, kuldegysninger, og rygsmerter. Desuden lider op til 20 % af patienter med UTI af tilbagevendende infektioner, hvilket resulterer i et dramatisk fald i antibiotikafølsomheden2,3,4. I de senere år har der været en stigende interesse for nye behandlingsformer for behandling og forebyggelse af tilbagevendende UTI. På trods af en bedre forståelse af den medfødte og adaptive immunitet i de nedre urinveje og af de bakterielle virulensfaktorer, der er nødvendige for invasion og kolonisering, er ingen radikale ændringer i behandlingsregimet blevet oversat til den daglige urologiske praksis2. For at studere UTI patogenese og modtagelighed in vivo, en reproducerbar og ikke-invasiv analyse er uundværlig.
Flere dyr UTI modeller er blevet beskrevet lige fra nematoder til primater, men murine model er overvejende anvendes5,6. Denne model består af transurethral kateterisering af (kvindelige) mus og efterfølgende instillation af en bakteriel suspension, oftest uropatogene Escherichia coli (UPEC), direkte ind i blæren lumen7. Efter podning er bakteriebelastningen traditionelt blevet kvantificeret ved at bestemme kolonidannende enheder (CFU). Denne teknik kræver, at dyr ofrer for at opnå post mortem organ homogenater og serielle fortyndinger, begrænse dataoutput og reproducerbarhed. Desuden er langsgående opfølgning af bakteriebelastningen hos individuelle dyr ikke mulig ved hjælp af denne teknik.
I 1995 foreslog Contag etal. brugen af bioluminescerende patogener til at overvåge sygdomsprocesser hos levende dyr8,9. Siden da er bioluminescensbilleddannelse (BLI) blevet anvendt på adskillige infektionsmodeller som meningitis, endocarditis, osteomyelitis, hud og bløddelsinfektioner osv.10,11,12. I murin UTI model, en UPEC stamme med den komplette lux operon (luxCDABE) fra Photorhabdus luminescens kan anvendes13. En enzymatisk reaktion katalyseret af bakteriel luciferase, som er afhængig af oxidation af langkædede aldehyd, der reagerer med reduceret flavinmonnukleotid i nærværelse af ilt, hvilket giver den oxiderede flavin, en langkædet fedtsyre og lys12. Lux operon koder for luciferase og andre enzymer, der kræves til syntesen af substraterne. Derfor vil alle metabolisk aktive bakterier kontinuerligt udsende blåt grønt (490 nm) lys uden behov for injektion af et udefrakommende substrat12. Fotoner, der udsendes af lux-taggedebakterier, kan fanges ved hjælp af meget følsomme, afkølede opladningskoblede enhedskameraer (CCD).
Brugen af bioluminescerende bakterier i en model for UTI giver mulighed for langsgående, ikke-invasiv kvantificering af bakteriebelastningen, udelade behovet for at ofre dyr på faste tidspunkter under opfølgningen for CFU bestemmelse. På trods af den brede vifte af muligheder, akkumulere beviser for robustheden af denne BLI teknik på andre områder og dens fordele i forhold til klassiske modeller af UTI, er det ikke blevet bredt gennemført i UTI forskning. Protokollen præsenteres her giver en detaljeret trin-for-trin guide og fremhæver fordelene ved BLI for alle fremtidige UTI forskning.
Fordele ved BLI i forhold til CFU tæller
Langsgående data
En væsentlig ulempe ved den traditionelle metode til optælling af CFU til kvantificering af mikrobielle byrder er kravet om post mortem organ homogenater, der kun giver et tværsnitsdatapunkt pr. dyr. Omvendt muliggør BLI ikke-invasiv langsgående opfølgning af inficerede dyr. Dyrene kan afbildes 2 til 3 gange om dagen, hvilket giver detaljeret indsigt i infektionens kinetika. Derudover reducerer gentagne foranstaltninger af d…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra Research Foundation – Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Ku Leuvens Forskningsråd (C1-TRPLe; T.V. og W.E.) og VIB (til T.V.). W.E. er senior klinisk forsker ved Research Foundation – Flanders (FWO Vlaanderen). Stammen UTI89-lux var en generøs gave fra Prof. Seed’s laboratorium13.
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
Vortex | VWR international | 444-1372 |