मूत्र पथ संक्रमण और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके चूहों में उनके उपचार का देशांतर अनुवर्ती
Summary
यह पांडुलिपि बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके बैक्टीरियल लोड के वीवो विश्लेषण में चूहों में मूत्र पथ संक्रमण और बाद में देशांतर को प्रेरित करने के लिए लक्स ऑपरन के साथ यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया के इंट्रावेसिकल प्रशासन का वर्णन करती है।
Abstract
मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) मनुष्यों में सबसे आम जीवाणु संक्रमण के बीच रैंक और नियमित रूप से अनुभवजन्य एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं । हालांकि, बढ़ते माइक्रोबियल प्रतिरोध के कारण, सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता में गिरावट आई है। वैकल्पिक उपचार विकल्प खोजने के लिए, यूटीआई रोगजनन और यूटीआई संवेदनशीलता निर्धारित करने वाले तंत्रों की बेहतर समझ की बहुत आवश्यकता है। एक पशु मॉडल में इसकी जांच करने के लिए, यूटीआई के पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए एक प्रजनन योग्य, गैर-आक्रामक परख अपरिहार्य है।
वर्षों के लिए, बैक्टीरियल लोड की गणना के लिए सोने के मानक एक विशेष नमूना मात्रा के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) का निर्धारण किया गया है । इस तकनीक के लिए पोस्टमार्टम अंग समरूपता और धारावाहिक कमजोर पड़ने, डेटा उत्पादन और प्रजनन क्षमता को सीमित करने की आवश्यकता होती है। एक विकल्प के रूप में, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। लक्स ऑपरन के साथ पैथोजन लेबलिंग संवेदनशील पता लगाने और मात्राकरण को गैर-आक्रामक तरीके से अनुमति देती है, जिससे देशांतर अनुवर्ती कार्रवाई को सक्षम किया जा सकता है। अभी तक यूटीआई रिसर्च में बीएली को अपनाना सीमित रहता है।
यह पांडुलिपि माउस मूत्र पथ संक्रमण मॉडल में ब्ली के व्यावहारिक कार्यान्वयन का वर्णन करती है। यहां, बैक्टीरिया, इंट्रावेस्टिकल इन्स्टिलेशन और इमेजिंग को बनाने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान किया जाता है। सीआईयू के साथ वीवो सहसंबंध की जांच की जाती है और एंटीबायोटिक-उपचारित जानवरों के साथ अनुपचारित संक्रमित जानवरों के बैक्टीरियल लोड की तुलना करके एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, वीवो यूटीआई मॉडल में ब्ली के कार्यान्वयन के लिए विशिष्ट लाभों, सीमाओं और विचारों पर चर्चा की जाती है। यूटीआई रिसर्च फील्ड में बीएआई के लागू होने से यूटीआई के रोगजननों पर शोध और यूटीआई को रोकने और इलाज के नए तरीकों की खोज में काफी सुविधा होगी।
Introduction
मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) मनुष्यों में सबसे आम जीवाणु संक्रमणों में से हैं। सभी महिलाओं में से लगभग आधी अपने जीवनकाल के दौरान एक रोगसूचक यूटीआई का अनुभवहोगा 1. मूत्राशय तक सीमित संक्रमण मूत्र आवृत्ति, तात्कालिकता, हेमेटुरिया, असंयम और दर्द में वृद्धि जैसे मूत्र लक्षणों को जन्म दे सकता है। जब संक्रमण ऊपरी मूत्र पथ पर चढ़ता है, तो रोगियों को अस्वस्थता, बुखार, ठंड लगना और पीठ दर्द के साथ पाइलोनेफ्राइटिस का विकास होता है। इसके अलावा , यूटीआई के 20% रोगी आवर्ती संक्रमणों से पीड़ित हैं जिसके परिणामस्वरूप एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में नाटकीय कमी आती है2,3,4. हाल के वर्षों में, आवर्ती यूटीआई के उपचार और रोकथाम के लिए उपन्यास चिकित्सा में रुचि बढ़ रही है। निचले मूत्र पथ की सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा और आक्रमण और उपनिवेशीकरण के लिए आवश्यक जीवाणु उग्रता कारकों की बेहतर समझ के बावजूद, उपचार शासन में कोई क्रांतिकारी परिवर्तन दैनिक मूत्र संबंधी अभ्यास2में अनुवाद नहीं किया गया है। वीवोमें यूटीआई रोगजनकता और संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक प्रजनन योग्य और गैर-आक्रामक परख अपरिहार्य है।
कई पशु यूटीआई मॉडल को नेमाटोड से लेकर वानरों तक का वर्णन किया गया है, लेकिन मुरीन मॉडल का मुख्य रूप से5, 6उपयोग कियाजाताहै। इस मॉडल में (महिला) चूहों के ट्रांसयूरेथ्रल कैथेटराइजेशन और बाद में बैक्टीरियल सस्पेंशन, सबसे अधिक यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) के इंस्टीलेशन होते हैं, सीधे मूत्राशय ल्यूमेन7में। टीका लगाने के बाद, बैक्टीरियल लोड को पारंपरिक रूप से कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएलयू) का निर्धारण करके निर्धारित किया गया है। इस तकनीक के लिए पशुओं को पोस्टमार्टम अंग समरूपता और धारावाहिक कमजोर पड़ने, डेटा उत्पादन और प्रजनन क्षमता को सीमित करने के लिए त्याग करने की आवश्यकता है । इसके अलावा, व्यक्तिगत जानवरों में बैक्टीरियल लोड का देशांतर अनुवर्ती इस तकनीक का उपयोग करना संभव नहीं है।
1995 में, छूत एट अलने जीवित जानवरों में रोग प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए बायोल्यूमिनेसेंट-टैग किए गए रोगजनकों के उपयोग का सुझाव दिया8,9। तब से, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (ब्ली) को कई संक्रमण मॉडलों जैसे मेनिनजाइटिस, एंडोकार्डाइटिस, ऑस्टियोमाइलाइटिस, त्वचा और मुलायम ऊतक संक्रमण आदिपरलागू किया गया है। मुरीन यूटीआई मॉडल में, फोटोराबडस ल्यूमिनेसेन्स से पूर्ण लक्स ऑपरन(लक्ससीडीएबी)के साथ एक यूपीईसी तनाव का उपयोग13किया जा सकता है। एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया बैक्टीरियल लूसिफ़ेरेस द्वारा उत्प्रेरित की जाती है जो ऑक्सीजन की उपस्थिति में कम फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड के साथ प्रतिक्रिया करने वाली लंबी श्रृंखला एल्डिहाइड के ऑक्सीकरण पर निर्भर करती है, ऑक्सीडाइज्ड फ्लेविन, एक लंबी श्रृंखला फैटी एसिड और प्रकाश12। सब्सट्रेट्स के संश्लेषण के लिए आवश्यक लूसिफ़ेरेस और अन्य एंजाइमों के लिए लक्स ऑपरन एन्कोड करता है। इसलिए, सभी मेटाबोलिक रूप से सक्रिय बैक्टीरिया लगातार एक एक्सोजेनस सब्सट्रेट12के इंजेक्शन की आवश्यकता के बिना नीले हरे (490 एनएम) प्रकाश का उत्सर्जन करेंगे। लक्स-टैगकिए गए बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित फोटॉन को अत्यधिक संवेदनशील, कूल्ड चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरों का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है।
यूटीआई के लिए एक मॉडल में बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया का उपयोग जीवाणु भार के देशांतर, गैर-आक्रामक मात्राकरण के लिए अनुमति देता है, जो सीआईयू निर्धारण के लिए अनुवर्ती के दौरान निश्चित समय बिंदुओं पर जानवरों के त्याग की आवश्यकता को छोड़ देता है। संभावनाओं की विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, अन्य क्षेत्रों में इस BLI तकनीक की मजबूती और यूटीआई के क्लासिक मॉडलों पर इसके फायदे के लिए सबूत जमा करना, इसे यूटीआई अनुसंधान में व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विस्तृत कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करता है और भविष्य के सभी यूटीआई अनुसंधान के लिए BLI के फायदों पर प्रकाश डालता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएलयू की तुलना में BLI के फायदे मायने रखता है
देशांतर डेटा
माइक्रोबियल बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए सीआईएफयू की गणना करने की पारंपरिक विधि का एक बड़ा नुकसान पोस्टमार्टम अंग समरूप की …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रिसर्च फाउंडेशन – फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ व्लांडरन) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; G0A6113N), केयू Leuven की अनुसंधान परिषद (C1-TRPLe; टीवी और डब्ल्यूई) और VIB (टीवी के लिए) । W.E. रिसर्च फाउंडेशन के एक वरिष्ठ नैदानिक शोधकर्ता है-Flanders (FWO Vlaanderen) । तनाव UTI89-लक्स प्रो बीज प्रयोगशाला13से एक उदार उपहार था ।
Materials
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
Riferimenti
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
