Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma
Summary
Portalveneninjektion von Darmkrebs (CRC) Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. Dieses Mausmodell der CRC-Lebermetastasierung stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Tumor-Stroma-Interaktionen zu untersuchen und neuartige Stroma-gerichtete Therapeutika wie Adeno-assoziierte virusvermittelte Gentherapien zu entwickeln.
Abstract
Die Lebermetastasierung von Darmkrebs (CRC) ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), ein Hauptbestandteil der Tumormikroumgebung, spielen eine entscheidende Rolle bei der metastasierenden CRC-Progression und prognostizieren eine schlechte Patientenprognose. Es fehlt jedoch an zufriedenstellenden Mausmodellen, um das Crosstalk zwischen metastasierenden Krebszellen und CAFs zu untersuchen. Hier stellen wir eine Methode vor, um zu untersuchen, wie das Fortschreiten der Lebermetastasierung durch die metastasierende Nische reguliert wird und möglicherweise durch eine stromagerichtete Therapie eingeschränkt werden könnte. Die Injektion von CRC-Organoiden in die Portalvene erzeugte eine desmoplastische Reaktion, die die fibroblastenreiche Histologie der menschlichen CRC-Lebermetastasen getreu rekapitulierte. Dieses Modell war gewebespezifisch mit einer höheren Tumorlast in der Leber im Vergleich zu einem intra-Milz-Injektionsmodell, was die Überlebensanalysen der Maus vereinfachte. Durch die Injektion von Luciferase-exprimierenden Tumororganoiden konnte die Kinetik des Tumorwachstums durch In-vivo-Bildgebung überwacht werden. Darüber hinaus bietet dieses präklinische Modell eine nützliche Plattform, um die Wirksamkeit von Therapeutika zu bewerten, die auf das Tumormesenchym abzielen. Wir beschreiben Methoden, um zu untersuchen, ob die adenoassoziierte virusvermittelte Abgabe eines tumorhemmenden Stroma-Gens an Hepatozyten die Tumormikroumgebung umgestalten und das Überleben der Maus verbessern könnte. Dieser Ansatz ermöglicht die Entwicklung und Bewertung neuartiger therapeutischer Strategien zur Hemmung der Lebermetastasierung von CRC.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist weltweit eine der Hauptursachen für die Krebssterblichkeit1. Mehr als die Hälfte der CRC-Patienten entwickeln eine Lebermetastase, die durch die Verbreitung der Pfortaderauftritt 1. Derzeit gibt es keine wirksamen Therapeutika, die fortgeschrittene Lebermetastasen heilen können, und die meisten Patienten erliegen einer metastasierenden Erkrankung.
Die metastasierende Nische oder Tumormikroumgebung spielt eine Schlüsselrolle bei der Transplantation und dem Wachstum von disseminierten CRC-Zellen2. Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), eine prominente Komponente der Tumormikroumgebung, fördern oder hemmen das Fortschreiten von Krebs durch Sekretion von Wachstumsfaktoren, Umgestaltung der extrazellulären Matrix (ECM) und Modulation von Immunlandschaften und Angiogenese 3,4,5. CAFs verleihen auch Resistenz gegen Chemotherapien und Immuntherapien3. Darüber hinaus regulieren CAFs den Beginn und das Fortschreiten der CRC-Lebermetastasierung und prognostizieren die Prognose bei Patienten mit CRC 3,6,7,8. So könnten CAF-bezogene Faktoren für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Hemmung der CRC-Lebermetastasierung genutzt werden. Das Fehlen zufriedenstellender Mausmodelle zur Untersuchung des metastasierenden Tumorstromas war jedoch ein großes Hindernis für die Entwicklung von stroma-zielgerichteten Therapien.
Derzeit umfassen Tiermodelle zur Untersuchung von CRC-Lebermetastasen primäre CRC-Modelle, die spontan Lebermetastasen und Krebszelltransplantationsmodelle in die Leber entwickeln. Primäre CRC-Mausmodelle, wie gentechnisch veränderte Mausmodelle und die Koloninjektion von Krebszellen, zeigen selten Metastasen in der Leber 9,10,11,12. Selbst wenn eine Lebermetastasierung beobachtet wird, zeigen diese Modelle eine lange Latenz von der primären Tumorinduktion bis zur Metastasierung und sterben möglicherweise an der primären Tumorlast12. Um CRC-Lebermetastasen effizient zu erzeugen, werden kultivierte CRC-Zellen mit drei Injektionsansätzen in die Leber transplantiert: Intra-Milz-Injektion, direkte intraparenchymale Injektion in die Leber und Pfortader-Injektion. Intra-splenal injizierte Krebszellen breiten sich in die Milzvene, die Pfortader, und schließlich in die Leberaus 13,14. Die intra-Milzinjektion ergibt jedoch ein niedrigeres Tumorentnahmeverhältnis im Vergleich zu anderen Transplantationsmodellen15,16. Bei der intra-Milzinjektion wird eine chirurgische Entfernung der Milz durchgeführt, um ein Krebswachstum in der Milz zu vermeiden, das möglicherweise die Reifung der Immunzellen beeinträchtigen kann17. Darüber hinaus kann die intra-splenische Injektion auch zu einem unbeabsichtigten Tumorwachstum in der Milz und der Bauchhöhle18 führen, was die Lebermetastasenanalysen erschwert. Direkte intraparenchymale Injektion in die Leber induziert effizient Lebermetastasen16,19,20. Nichtsdestotrotz rekapituliert dieser Ansatz einen biologischen Schritt der Lebermetastasierung, der natürlich durch die Verbreitung von Pfortaden auftritt, nicht vollständig. Durch direkte Injektion in die Leber kann der Eintritt von Krebszellen in ein Nicht-Portal, aber systemische Zirkulation auch zu mehreren großen Lungenmetastasen führen16. Obwohl eine Mehrheit der Patienten mit CRC-Lebermetastasen mehrere Tumorknoten in der Leberzeigt 21, erzeugt die direkte Injektion in einen spezifischen Leberlappen eine einzige Tumormasse 19,20. Die Injektion von Portalvenen oder Mesenterialvenen ist zwar technisch anspruchsvoll, ermöglicht jedoch eine effiziente Abgabe von Tumorzellen in die Leber auf eine Weise, die die bei Patienten beobachteten Wachstumsmuster rekapituliert17. Diese Strategie kann die Möglichkeit von Metastasen an der Sekundärstelle minimieren und ermöglicht ein schnelles Wachstum von Krebszellen in der Leber, was die Überlebensanalysen der Maus vereinfacht.
Historisch gesehen wurden Darmkrebszelllinien wie Maus MC-38, humanes HT-29 und SW-620 verwendet, um Mausmodelle der Lebermetastasierung22,23 zu erzeugen. Diese Darmkrebs-Zelllinien induzieren jedoch keine desmoplastische Stromareaktion. Der niedrige Stromagehalt in den Tumoren macht es schwierig, die biologische Rolle von Krebs-assoziierten Fibroblasten zu untersuchen. Jüngste Fortschritte bei CRC-Organoiden und ihrer Transplantation haben nützliche Plattformen geboten, um die lebenswichtige Rolle des Stromas bei der Krebsprogressionzu beurteilen 24. Die Lebertransplantation von CRC-Organoiden erzeugt eine fibroblastenreiche Tumormikroumgebung und hat neue Einblicke in die Stromaforschunggegeben 6,25. Derzeit ist die Injektion von Organoiden in portale oder mesenterische Venen zu einem Goldstandardansatz geworden, um CRC-Lebermetastasen zu erzeugen 6,25,26,27,28. Nichtsdestotrotz haben unseres Wissens keine früheren Arbeiten detaillierte Methoden zur Pfortaderinjektion von kolorektalen Tumoroiden beschrieben. Hier stellen wir eine Methodik zur Verwendung der Portalveneninjektion von CRC-Organoiden zur Entwicklung einer neuartigen Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Stroma-gerichteten Therapie vor.
Hepatozyten sind ein wichtiger Bestandteil der metastasierenden Tumormikroumgebung in der Leber und spielen eine entscheidende Rolle bei der Progression von metastasierendem Krebs29. Inspiriert vom Erfolg von AAV-Gentherapieansätzen zur Induktion der Proteinexpression in Hepatozyten bei nicht-neoplastischen Patienten30,31 untersuchten wir einen ähnlichen Ansatz, der jedoch darauf abzielte, die Mikroumgebung des Lebertumors im SFB25 zu modifizieren. Als solche beschreiben wir hierin auch die Schwanzveneninjektion von AAV8, um die Expression von antitumorigenen Proteinen zu induzieren, um die Mikroumgebung des Lebertumors zu modifizieren. Der AAV8-Serotyp, der durch die Wahl des viralen Kapsidproteins während der Virusproduktion bestimmt wird, führt zu einer hohen Transduktionseffizienz speziell von Hepatozyten (d.h. gezielte Genexpression in der Mikroumgebung des Lebertumors)32. Wir haben bereits gezeigt, dass Islr (Immunglobulin-Superfamilie mit Leucin-reicher Wiederholung) ein CAF-spezifisches Gen ist, das die Signalgebung von Knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP) induziert, das Wachstum von CRC-Tumoroiden reduziert und die Differenzierung von Lgr5+ intestinalen Stammzellen fördert25. Wir testeten, ob eine AAV8-vermittelte Überexpression des krebshemmenden Stroma-Gens Islr in Hepatozyten die Progression der hepatischen Metastasierung abschwächen könnte, indem bei AAV8-Islr-behandelten Mäusen eine Pfortveneninjektion von CRC-Tumoroiden durchgeführt wurde.
In diesem Artikel beschreiben wir zunächst das Injektionsverfahren für die Heckvene von lebertropischem AAV. Dann beschreiben wir eine Methode zur Vorbereitung tumoroider Zellen und zur Injektion von Pfortader in die AAV-behandelten Mäuse. Schließlich stellen wir Ansätze zur Überwachung der Progression metastasierender Tumore vor, um die Wirksamkeit von stromagerichteten Therapeutika zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Pfortaderinjektion von Maus-CRC-Organoiden reproduzierbar fibroblastenreiche Lebermetastasen erzeugt, die histologische Merkmale menschlicher CRC-Lebermetastasen nachahmen. Darüber hinaus dient dieses präklinische Modell in Kombination mit stromagerichteten Therapeutika wie der AAV8-vermittelten Gentherapie als nützliches Werkzeug, um therapeutische Wirkungen auf das Überleben der Maus und das Tumorwachstum zu bewerten.
Es gibt mindestens zwei k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council (APP1156391 an D.L.W., S.L.W.) unterstützt. (APP1081852 zu D.L.W., APP1140236 zu S.L.W., APP1099283 zu D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project im Namen seiner Spender und der Regierung des Bundesstaates Südaustralien über das Gesundheitsministerium (MCF0418 an S.L.W., D.L.W.); ein Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03467 to M.T.), das vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Auftrag gegeben wurde; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 und 19gm1210008s0101 bis A.E.); das Projekt für Krebsforschung und therapeutische Evolution (P-CREATE) von AMED (19cm0106332h0002 bis A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (zu H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (zu H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (zu H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (zu K.G.).
Wir danken Dr. Leszek Lisowski von der Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), dem Children’s Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIEN) für die Herstellung rekombinanter AAV-Vektoren.
Materials
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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