Summary
Vi gir en detaljert beskrivelse av trinnene som kreves for å montere en høytrykkscelle, sette opp og registrere høytrykks NMR-eksperimenter, og til slutt analysere både toppintensitet og kjemiske skiftendringer under trykk. Disse eksperimentene kan gi verdifull innsikt i foldeveiene og strukturell stabilitet av proteiner.
Abstract
Høyt trykk er en velkjent perturbasjonsmetode som kan brukes til å destabilisere kuleproteiner og dissosiere proteinkomplekser på en reversibel måte. Hydrostatisk trykk driver termodynamisk likevekt mot staten(e) med lavere molarvolum. Økende trykk gir derfor mulighetene til å finjustere stabiliteten til kulelige proteiner og oligomeriseringslikevekten til proteinkomplekser. Høytrykks NMR-eksperimenter tillater en detaljert karakterisering av faktorene som styrer stabiliteten til kuleformede proteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved å kombinere den fine stabilitetsjusteringsevnen til trykkperturbasjon og stedsoppløsningen som tilbys av løsning NMR-spektroskopi. Her presenterer vi en protokoll for å sondere den lokale foldestabiliteten til et protein via et sett med 2D 1H-15N eksperimenter registrert fra 1 bar til 2,5 kbar. Trinnene som kreves for innsamling og analyse av slike eksperimenter er illustrert med data innhentet på RRM2-domenet til hnRNPA1.
Introduction
Det har lenge vært anerkjent at høyere energi, tynt befolkede konformasjonstilstander av proteiner og proteinkomplekser spiller en nøkkelrolle i mange biologiske veier1,2,3. Takket være eksperimenter basert på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5, og mørk-tilstand utveksling metningsoverføring (DEST)6 pulssekvenser (blant annet), løsning NMR spektroskopi har dukket opp som en metode for valg for karakterisering av forbigående konformasjonstilstander7. Sammen med disse eksperimentene kan perturbasjoner som temperatur, pH eller kjemiske denaturer innføres for å øke den relative populasjonen av høyere energikonformasjonstilstander. På samme måte kan proteinlikevekter også bli forstyrret ved å bruke høyt hydrostatisk trykk. Avhengig av størrelsen på volumendringen forbundet med de tilsvarende konformasjonsendringene, kan en økning av trykket med noen få hundre til noen få tusen barer stabilisere en høyere energitilstand eller føre til at et protein helt utfolder seg8,9,10. Protein NMR spektra viser vanligvis to typer endringer med hydrostatisk trykk: (i) kjemiske skiftendringer og (ii) toppintensitetsendringer. Kjemiske skiftendringer gjenspeiler endringer i proteinoverflatevanngrensesnittet og/eller lokal kompresjon av proteinstrukturen på rask tidsskala (i forhold til NMR-tidsskala)11. Crosspeaks som viser store ikke-lineære kjemiske skift trykkavhengighet kan indikere tilstedeværelsen av høyere energikonformasjonstilstander12,13. På den annen side peker endringer i toppintensiteten på store konformasjonsoverganger på en langsom tidsskala, for eksempel endringer i brettede/utfoldede tilstandspopulasjoner. Tilstedeværelsen av sammenleggbare mellomprodukter eller høyere energitilstander kan påvises fra store variasjoner i volumendringens størrelse ved utfoldelse målt for forskjellige rester av et gitt protein14,15,16,17. Basert på vår erfaring viser selv små proteiner som vanligvis er klassifisert som tostatsmapper ikke-ensartede respons på trykk, noe som gir nyttig informasjon om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokoll for oppkjøp og analyse av blant toppintensitet og 1H kjemiske skift trykkavhengighet, ved hjelp av som modellprotein det isolerte RNA-anerkjennelsesmotivet 2 (RRM2) av det heterogene kjernefysiske ribonukleoproteinet A1 (hnRNPA1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen som er beskrevet her krever (i) en høytrykkspumpe og celle med et 2,5 kbar-klassifisert aluminiums-herdet zirkoniarør18, (ii) programvaren SPARKY19 for analyse av NMR-spektraet, og (iii) en programvare for kurvetilpasning.
1. Prøvepreparering, montering av høytrykkscellen og oppsett av forsøkene.
- Valg av buffer: Bruk lik blanding av anioniske og kationiske buffere, for eksempel fosfat og Tris20,21.
MERK: pKa av anioniske buffere som fosfat og MES er forbundet med et betydelig reaksjonsvolum (dvs. forskjellen i de delvise molale volumene av syren og de ioniserte produktene). pH for slike buffere kan derfor påvirkes betydelig av trykkendring (~0,25-0,5 pH-enhet/kbar). - Forsikre deg om at det nødvendige prøvevolumet ligner på et standard NMR-rør med 3 mm diameter (~ 300μL).
- Introduser den 15N-merkede prøven med en glasspipette i zirkoniarøret. Pass på at prøvesetene nederst på røret. Komplett med 200 μL mineralolje for å hindre at prøven blandes med transmisjonsvæsken (f.eks. vann). Fyll resten av røret med transmisjonsvæske.
- Sett en flerbruks O-ring oppå zirkoniarøret og skyv røret inn i sokkelen (Figur 1A,B). Deretter kobler du røret til høytrykkslenkelinjen og strammer basen til cellen først for hånd. Påfør deretter 14,7 Nm dreiemoment for å forhindre lekkasjer ved lavere trykk (Figur 1C,D).
- For å kontrollere integriteten til trykkcelleenheten, trykk på røret opp til 300 bar utenfor spektrometeret ved hjelp av cellestøtte og inneslutningsbeholder. Vent i 15 min, tilbakestill trykket til 1 bar og se etter lekkasjer med en ren lofri klut.
- Sett det trykksatte røret inn i spektrometeret ved å føre tetherlinjen forsiktig. Skyv røret i spektrometeret til du når prøvestillingen (Figur 1E).
- Lås, shim, match og still inn 1H- og 15N-kanalene som vanlig.
MERK: Shims for høytrykksrangerte zirkoniarør er svært forskjellige fra standard NMR-rør. Det anbefales å lagre de optimaliserte avstandsskivene for fremtidig bruk. - Sett opp en 1H-15N-HSQC eller TROSY-HSQC og registrer et referanseeksperiment ved atmosfæriske forhold (1bar).
2. Registrering av NMR-eksperimenter med høyt trykk
- Gradvis øke trykket fra 1 bar til 2,5 kbar med 500 bar trinn for å teste den generelle stabiliteten til proteinet. Still inn hastigheten på trykkpumpen som standard på ~ 18 bar / s. Hvis de nøyaktige folde-/utfoldelseshastighetene ikke er kjent, la prøven likevekte 15-20 min etter hver trinn på 500 bar. Registrer et spektrum på 2,5 kbar.
- Reduser trykket gradvis tilbake til 1 bar med 500 bar trinn for å teste reversibiliteten til trykkperturbasjonen. Registrer et annet spektrum ved atmosfæriske forhold og sammenlign de kjemiske skiftene og toppintensitetene med referansespekteret som tidligere er registrert under de samme forholdene.
MERK: Hvis de innfødte kryssfunksjonene er mer intense etter trykkløpet, kan det tyde på at små aggregater som finnes i oppløsning ved atmosfærisk trykk, kan ha dissosiert og riktig brettet. På den annen side tyder et tap i intensiteten eller betydelige kjemiske skiftendringer på at proteinet kan oppleve en ikke-reversibel feilfolding under høytrykksforhold. - Ta opp en serie med 2D-eksperimenter fra 1 bar til 2,5 kbar hver 500 bar. Det anbefales å registrere flere eksperimenter nær bøyningspunktet for folde-/utfoldelsesovergangen for å forbedre presisjonen til passformen.
3. Analysere endringer i toppintensitet
- Behandle alt spektra og overfør ryggraden oppdraget fra referansespekteret på 1 bar til spekteret registrert på 500 bar, og deretter overføre oppdraget fra 500 bar til 1 kbar og så videre.
MERK: Fordi trykket induserer et ikke-ensartet skift på 1H og 15N kjemiske skift, må du ikke bare kopiere ryggradsoppdraget fra ett spektrum til det neste. Juster den manuelt. - På Sparky -menyen klikker du Peak > Peak List (lt). I vinduet Toppliste klikker du alternativer og velger alternativet for å vise både frekvenser (ppm) og datahøyde. Lagre listen som er oppnådd for hvert spektrum.
- I en programvare for kurvetilpasning kopierer du verdiene for tverrbjelkeidentitet og toppintensitet for å ha trykkverdiene (i stolpe) som X-aksevariabel og intensiteten som Y-aksevariabel.
- Hvis en fullstendig eller nær fullstendig (>80%) utfoldelse observeres, passer du til de enkelte toppintensitetsprofilene for å trekke ut den frie energi- og volumendringen ved utfolding, henholdsvis ved hjelp av en enkel tostatsmodell:
Eq. 1
Hvor, "jeg" er den observerte intensiteten av en crosspeak ved en gitt trykk p og IF er intensiteten av samme crosspeak i en fullt foldet tilstand. R er gasskonstanten, T er den absolutte temperaturen, ΔGU0 standard Gibbs fri energiforskjell mellom utfoldede og brettede tilstander ved atmosfærisk trykk p0 (1 bar) og ΔVu volumendringen ved utfoldelse. Med trykk p i bar og temperatur T i kelvin, R = 1.987 cal/K, ΔGU0 er i cal/mol, og ΔVU er i cal/mol/bar. Multipliser ΔVU-verdiene oppnådd fra passformen med 41,84 for å konvertere til ml / mol. ΔVU-verdier er vanligvis i området -50 til -150 ml / mol for kuleformede proteiner22. Her uttrykkes alle parametrene med hensyn til den utfoldende reaksjonen, men kan lett konverteres til sammenleggbare reaksjonsparametere (ΔGU0 = -ΔGF0 og ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Analysere kjemiske skiftendringer
- Ordne kolonnene i programvaren for å ha trykkpunkter som variable og 1H kjemiske skift hentet fra Sparky lister som Y-aksen.
- Monter trykkavhengigheten til 1H kjemiske skift til en enkel kvadratisk ligning:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
Hvor, δ(p) er det målte 1H kjemiske skiftet av en crosspeak ved en gitt trykk p og δ0(p0) de 1H kjemiske skiftene av samme crosspeak i referansespekteret registrert på 1 bar. B1 og B2 representerer henholdsvis første og andreordensparametere uttrykt i henholdsvis ppm/bar og ppm/bar2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her ble brukt til å sondere trykkavhengigheten til RRM2, det andre RNA-anerkjennelsesmotivet til hnRNPA1 (rester 95-106), som nesten er helt utfoldet innenfor 2,5 kbarområdet (>90%). 1 H-15N spektra ble samlet inn i 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar og 2,5 kbar (figur 2). Siden ingen av de innfødte krysspeakene var synlige over støynivået på 2,5 kbar, ble alle tilsvarende rester tilskrevet en intensitetsverdi på 0 ved dette trykket (figur 3A). Totalt 45 individuelle trykkintensitetsprofiler ble montert i henhold til ligning 1 (Eq. 1) for å oppnå de tilsvarende endringene i standard Gibbs frienergi (ΔGU0) og volum (ΔVU) forbundet med utfoldende reaksjon (figur 3A). De beregnede ΔVU-verdiene varierte fra -41 til -88 ml/mol og ΔGU0 fra 1,8-3,3 kcal/mol. Når den er kartlagt på domenestrukturen (pdb 1U1R), ser det ut til at rester med størst volumendring er funnet i domenestrukturkjernen (i rødt, i figur 3B), mens de med den minste størrelsen på volumendring hovedsakelig ligger i løkken som forbinder β-trådene 2 og 3, og løkken som kobler β-strand 4 til C-terminal helix (i grønn, grønn, og løkken som kobler β-strand 4 til C-terminal helix (i grønn, grønn, Figur 3B). Trykkavhengigheten til de innfødte ryggradene 1H kjemiske skift ble også analysert for å undersøke graden av komprimerbarhet og konformasjons heterogenitet av det brettede tilstandsensemblet. Individuelle profiler på 1H kjemiske skift som trykkfunksjon ble montert ved hjelp av Eq. 2 for å trekke ut stedsspesifikke lineære (B1) og ikke-lineære (B2) koeffisienter (figur 3C). Rester med de største ikke-lineære koeffisientene ble for det meste funnet i den strukturelle kjernen av domenet (i gul, figur 3D), mens rester med de minste ikke-lineære koeffisientene for det meste var plassert i løkker som forbinder de forskjellige strukturelle motivene (i blått, figur 3D).
Figur 1: Høytrykkscelleenhet og installasjon i spektrometeret. (A-D) Den fulle høytrykkscelleenheten krever et zirkonia-rør, en engangs O-ring, cellebasen (A, B). Røret er koblet til tetherlinjen ved å stramme basen til cellen (C,D). 14,7 Nm dreiemoment er nødvendig for å forhindre lekkasjer ved lavere trykk. (E) Zirkonia-røret som er koblet til Xtreme-60 sprøytepumpen via tetherlinjen, innføres i spektrometeret til det når normal prøvestilling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utfolding av hnRNPA1 RRM2-domene under trykk. 1H-15N HSQC-spektra samlet på (A) 1 bar, (B) 1000 bar, (C) 1500 bar, (D) og 2500 bar viser en fullstendig utfoldelse av RRM2-domenet under trykk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse av RRM2-toppintensitet og 1H kjemiske skifttrykkavhengighet. (A) Representative toppintensitetsprofiler registrert for RRM2 mellom 1 og 2000 bar. Faste linjer representerer passformen som oppnås ved hjelp av Eq. 1 for å beregne de tilsvarende standard frienergi- og volumendringene knyttet til utfoldelsesreaksjonen. (B) De øverste 25 % av rester med den største målte størrelsen på ΔVU er uthevet med røde sfærer på RRM2-referansestrukturen (pdb 1U1R). Rester med den minste størrelsen på ΔVU er vist i grønt. (C) Representative endringer av 1H kjemiske skift målt for RRM2 mellom 1 bar og 2000 bar. Heltrukne linjer representerer tilpasningen til Eq. 2 for å beregne de lineære (B1) og ikke-lineære (B2) trykkkoeffisientene. (D) De øverste 25 % av rester med de største B 2-koeffisientene vises i gult, mens de med de minste B2-koeffisientene vises i blått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien beskriver en protokoll implementert for å undersøke proteinstrukturelle og termodynamikkresponser på trykkperturbasjon. Høytrykkseksperimentene som er registrert her på RRM2, viser at store variasjoner i ΔVU-verdier, som indikerer ikke-fullt samarbeidsvillig utfoldelse, finnes i et relativt lite enkelt domeneprotein. Et lignende bilde kommer ut av analysen av 1H kjemiske skiftendringer under trykk. Det skal bemerkes kalbitzer og kolleger har vist at en mer dyptgående analyse av kjemiske skiftendringer kan utføres som knytter forholdet mellom ikke-lineære og lineære koeffisienter (B2/ B1) med forholdet mellom endringen i komprimerbarhet og volum (Δβ / ΔV)23. Disse resultatene fremhever evnen til høyt hydrostatisk trykk til å destabilisere individuelle strukturelle motiver og underdomener basert på lokal termodynamisk stabilitet og volumendring forbundet med utfoldelse. Registrering av et enkelt sett med trykktitreringseksperimenter kan derfor gi verdifull informasjon om foldemekanismene og underdomenearkitekturen til et protein.
Hele trykksystemet (pumpe og kontroller) er relativt kompakt og kan installeres på en standard verktøyvogn for enkel tilgang til spektrometeret (figur 1). Alle pulssekvenser kan brukes under trykk uten modifikasjon, inkludert trippel resonanseksperimenter. Den eneste begrensningen er at trykkrangerte zirkonia-rør reduserer følsomheten til NMR-eksperimenter med nesten 50% sammenlignet med et standard NMR-rør med 3 mm diameter. Dette kan være en utfordring for proteinprøver som ikke kan konsentreres til et høyt nok nivå. Sammenlignet med andre perturbasjonsmetoder som temperatur eller kjemiske denaturanter, gir hydrostatisk trykk fordelen av å være, med svært få unntak, fullt reversibel. Fordi trykk favoriserer dissosiasjon av proteinkomplekser, er det for eksempel svært liten risiko for prøveaggregering, et problem som ofte oppstår med høye temperaturer.
Mens hydrostatisk trykk er et kraftig verktøy for å studere proteinstabilitet, er det viktig å huske på at det ikke er noen perfekt metode for perturbasjon. Hver av dem fremhever spesifisiteten til et proteinfritt energilandskap på en annen måte. For eksempel, hvis to konformasjonstilstander har samme molarvolum, vil en økning i hydrostatisk trykk ikke endre sine relative populasjoner betydelig. På samme måte, hvis to konformasjonstilstander har et lignende eksponert overflateareal, vil det å legge til kjemiske denaturanter ikke nødvendigvis øke den relative befolkningen i en stat sammenlignet med den andre. Ideelt sett bør forskjellige perturbasjonsmetoder kombineres for å få en fullstendig beskrivelse av et proteinfritt energilandskap15,24. Til slutt bør det bemerkes at selv om manuskriptet er fokusert på trykkavhengighet av intensitet og kjemiske skift fra serie 2D 1H-15N eksperimenter målt ved likevekt, kan et bredt spekter av NMR-eksperimenter kobles til trykkperturbasjon for å undersøke forskjellige aspekter av stabiliteten, foldemekanismen og konformasjonsdynamikken til proteiner og proteinkomplekser20, 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne har lest og godkjent manuskriptet. De erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker J. D. Levengood og B. S. Tolbert for vennlig å gi RRM2-prøven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R.
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
