Summary
Vi ger en detaljerad beskrivning av de steg som krävs för att montera en högtryckscell, ställa in och registrera NMR-experiment med högt tryck och slutligen analysera både toppintensitet och kemiska skiftförändringar under tryck. Dessa experiment kan ge värdefulla insikter om proteinens vikningsvägar och strukturella stabilitet.
Abstract
Högt tryck är en välkänd störmetod som kan användas för att destabilisera klotformiga proteiner och dissociera proteinkomplex på ett reversibelt sätt. Hydrostatiskt tryck driver termodynamisk jämvikt mot tillstånden med den nedre molära volymen. Att öka trycket erbjuder därför möjligheterna att finjustera stabiliteten hos klotformiga proteiner och oligomeriseringsjämvikten hos proteinkomplex. Nmr-experiment med högt tryck möjliggör en detaljerad karakterisering av de faktorer som styr stabiliteten hos klotformiga proteiner, deras vikmekanismer och oligomeriseringsmekanismer genom att kombinera den finstabilitetsjusteringsförmågan hos tryckstörning och den platsupplösning som erbjuds av lösning NMR-spektroskopi. Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka den lokala vikningsstabiliteten hos ett protein via en uppsättning 2D 1H-15N-experiment inspelade från 1 bar till 2,5 kbar. De steg som krävs för förvärv och analys av sådana experiment illustreras med data som förvärvats på RRM2-domänen hnRNPA1.
Introduction
Det har länge erkänts att glesbefolkade konformations tillstånd av proteiner och proteinkomplex spelar en nyckelroll i många biologiska vägar1,2,3. Tack vare experiment baserade på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5, och mörkstatsväxlingsmättnadsöverföring (DEST)6 pulssekvenser (bland andra), har lösning NMR-spektroskopi dykt upp som en metod för att karakterisera övergående konformationstillstånd7. Tillsammans med dessa experiment kan reaktioner som temperatur, pH eller kemiska denatureringsmedel införas för att öka den relativa populationen av högre energikonformationsunderstater. På samma sätt kan proteinjämvikt också störs genom att applicera högt hydrostatiskt tryck. Beroende på storleken på volymförändringen i samband med motsvarande konformationsförändringar kan en ökning av trycket med några hundra till några tusen staplar avsevärt stabilisera ett högre energitillstånd eller orsaka att ett protein helt utvecklas8,9,10. Protein NMR-spektra uppvisar vanligtvis två typer av förändringar med hydrostatiskt tryck: (i) kemiska skiftförändringar och (ii) högsta intensitetsförändringar. Förändringar i kemiskt skifte återspeglar förändringar vid proteinets ytvattengränssnitt och/eller lokal kompression av proteinstrukturen på en snabb tidsskala (i förhållande till NMR-tidsskalan)11. Crosspeaks som uppvisar stora icke-linjära kemiska skiftningar tryckberoende kan indikera förekomsten av högre energikonformations tillstånd12,13. Å andra sidan pekar toppintensitetsförändringar på stora konformationsövergångar på en långsam tidsskala, till exempel förändringar i vikta/utfällda tillståndspopulationer. Förekomsten av vikbara intermediärer eller högre energilägen kan detekteras från stora variationer i volymförändringens storlek vid utfällning mätt för olika rester av ett givet protein14,15,16,17. Baserat på vår erfarenhet uppvisar även små proteiner som vanligtvis klassificeras som tvåstatsmappar icke-enhetliga svar på tryck, vilket ger användbar information om deras lokala vikstabilitet. Beskrivs här är ett protokoll för förvärv och analys av amide topp intensitet och 1H kemikalie skiftar tryckberoende, med hjälp av som modellprotein det isolerade RNA erkännande motivet 2 (RRM2) av heterogeneous kärn- ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet som beskrivs här kräver (i) en högtryckspump och cell med en 2,5 kbar-klassad aluminiumhärdad zirconiarör18, (ii) programvaran SPARKY19 för analys av NMR-spektra och (iii) en kurvmonteringsprogramvara.
1. Provberedning, montering av högtryckscellen och inrättandet av experimenten.
- Val av buffert: Använd lika blandning av anjoniska och katjoniska buffertar, såsom fosfat och tris20,21.
OBS: pKa av anjonbuffertar som fosfat och MES är förknippat med en betydande reaktionsvolym (dvs. skillnaden i de partiella molala volymerna av syran och joniserade produkter). PH-talet för sådana buffertar kan därför påverkas avsevärt av ett tryckförändring (~0,25-0,5 pH-enhet/kbar). - Se till att den erforderliga provvolymen liknar den för ett NMR-rör med en diameter på 3 mm (~300 μL).
- Introducera det 15N-märkta provet med en glaspipett i zirconiaröret. Se till att provsätena längst ner på röret. Komplett med 200 μL mineralolja för att förhindra att provet blandas med överföringsvätskan (t.ex. vatten). Fyll resten av röret med transmissionsvätska.
- Sätt en O-ring för engångsbruk ovanpå zirconiaröret och skjut in röret i basen (figur 1A,B). Anslut sedan röret till högtrycksförtjuderlinjen och dra åt basen till cellen först för hand. Applicera sedan 14,7 Nm vridmoment för att förhindra läckage vid lägre tryck (Figur 1C, D).
- För att kontrollera tryckcellsenhetens integritet, tryck på röret upp till 300 bar utanför spektrometern med hjälp av cellstöd och inneslutningskärl. Vänta i 15 min, återställ trycket till 1 bar och kontrollera om det finns läckor med en ren luddfri våtservett.
- För in det trycksatta röret i spektrometern genom att försiktigt styra tjuderlinjen. Skjut röret i spektrometern tills du når prov sittplatsen (Bild 1E).
- Lås, shim, matcha och finjustera 1H- och 15N-kanalerna som vanligt.
OBS: Shims för högtrycksklassade zirconiarör skiljer sig mycket från vanliga NMR-rör. Vi rekommenderar att du sparar de optimerade shims för framtida användning. - Ställ in en 1H-15N-HSQC eller TROSY-HSQC och registrera ett referensexperiment vid atmosfäriska förhållanden (1bar).
2. Inspelning av NMR-experiment med högt tryck
- Öka gradvis trycket från 1 bar till 2,5 kbar med steg om 500 bar för att testa proteinens totala stabilitet. Ställ in tryckpumpens hastighet som standard på ~18 bar/s. Om de exakta viknings-/utfällningshastigheterna inte är kända, låt provet jämkalibrera 15–20 min efter varje steg på 500 bar. Spela in ett spektrum på 2,5 kbar.
- Minska gradvis trycket tillbaka till 1 bar med 500 bar steg för att testa reversibiliteten hos tryckstörningen. Registrera ett annat spektrum vid atmosfäriska förhållanden och jämför de kemiska förskjutningarna och toppintensiteterna med det referensspektrum som tidigare registrerats under samma förhållanden.
OBS: Om de inhemska korsbanden är mer intensiva efter tryckkörningen kan det tyda på att små aggregat som finns i lösningen vid atmosfärstryck kan ha avskild och återveckats ordentligt. Å andra sidan tyder en förlust i intensitet eller betydande kemiska förändringar på att proteinet kan uppleva en icke-reversibel felfoldning i högtrycksförhållanden. - Spela in en serie 2D-experiment från 1 bar till 2,5 kbar var 500:e stapel. Det rekommenderas att spela in ytterligare experiment nära böjningspunkten för den vikbara / utfällbara övergången för att förbättra passformens precision.
3. Analysera förändringar i toppintensitet
- Bearbeta alla spektra och överför stamnätstilldelningen från referensspektrumet vid 1 stapel till det spektrum som registrerats i 500 bar och överför sedan tilldelningen från 500 bar till 1 kbar och så vidare.
OBS: Eftersom tryck inducerar en icke-enhetlig förskjutning av 1H och 15N kemiska skift, kopiera inte bara stamnätstilldelningen från ett spektrum till ett annat. Justera den manuellt. - Klicka på Peak > Peak List (lt) på Sparky-menyn. I fönstret Topplista klickar du på Alternativ och väljer alternativet att visa både frekvenser (ppm) och datahöjd. Spara listan som erhållits för varje spektrum.
- I en kurvkopplingsprogramvara kopierar du korspeakidentiteten och toppintensitetsvärdena för att ha tryckvärdena (i stapeln) som X-axelvariabel och intensiteten som Y-axelvariabel.
- Om en fullständig eller nära fullständig (>80%) utfällning observeras, montera de enskilda toppintensitetsprofilerna för att extrahera den fria energi- och volymförändringen vid utfällning, med hjälp av en enkel tvåstatsmodell:
Eq. 1
Där "I" är den observerade intensiteten hos en crosspeak vid ett givet tryck p och IF är intensiteten i samma crosspeak i ett helt vikt tillstånd. R är gaskonstanten, T är den absoluta temperaturen, ΔGU0 standard Gibbs fri energiskillnad mellan utfällda och vikta tillstånd vid atmosfärstryck p0 (1 bar) och ΔVu volymförändringen vid utfällning. Med tryckp i bar och temperatur T i kelvin, R = 1,987 cal/K, är ΔGU0 i kal/mol och ΔVU är i cal/mol/bar. Multiplicera de ΔVU-värden som erhålls från passformen med 41,84 för att omvandlas till ml/mol. ΔVU-värdena ligger vanligtvis i intervallet -50 till -150 ml/mol för klotformiga proteiner22. Här uttrycks alla parametrar med avseende på den utfällbara reaktionen men kan enkelt omvandlas till vikbara reaktionsparametrar (ΔGU0 = -ΔGF0 och ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Analysera förändringar i kemiska skiften
- Ordna kolumnerna i programvaran för att få tryckpunkter som variabel och de 1 H kemiska skiftenextraherade från Sparky-listorna som Y-axeln.
- Passa tryckberoendet av 1 H-kemikalienskiftar till en enkel kvadratisk ekvation:
δ p= δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2
Därδ( p)är den uppmätta kemiska förskjutningen på 1H av ett tvärsnitt vid ett givet tryck p och δ0(p0) de kemiska förskjutningarna på 1H av samma tvärsnitt i referensspektrumet som registrerats vid 1 bar. B1 och B2 representerar den första och andra ordningens parametrar uttryckta i ppm/bar respektive ppm/bar2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här användes för att undersöka tryckberoendet av RRM2, det andra RNA-igenkänningsmotivet för hnRNPA1 (rester 95-106), som nästan helt utvecklas inom intervallet 2,5 kbar (>90%). 1 (på 1) H-15N spektra samlades in på 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar och 2,5 kbar(figur 2). Eftersom ingen av de inhemska korsstötarna var synliga över bullernivån vid 2,5 kbar, tillskrevs alla motsvarande restprodukter ett intensitetsvärde på 0 vid detta tryck (figur 3A). Totalt 45 individuella tryckintensitetsprofiler monterades enligt ekvation 1 (Eq. 1) för att erhålla motsvarande förändringar i standard Gibbs frienergi (ΔGU0) och volym (ΔVU)i samband med den utfällande reaktionen (figur 3A). De beräknade ΔVU-värdena varierade från -41 till -88 ml/mol och ΔGU0 från 1,8-3,3 kcal/mol. När den mappas på domänstrukturen (pdb 1U1R) verkar det som om rester med den största volymförändringens storlek finns inom domänens strukturella kärna (i rött, i figur 3B), medan de med den minsta volymförändringsstorleken huvudsakligen finns i slingan som förbinder β-strängarna 2 och 3 och slingan som förbinder β-strand 4 med C-terminal helix (i grönt, Figur 3B). Tryckberoendet av den inhemska ryggraden 1H kemiska skiften analyserades också för att undersöka graden av kompressibility och conformational heterogenitet i den vikta staten ensemble. Individuella profiler av 1H kemiska förskjutningar som tryckfunktion monterades med hjälp av Eq. 2 för att extrahera platsspecifika linjära (B1)och icke-linjära (B2)koefficienter(figur 3C). Resthalterna med de största icke-linjära koefficienterna hittades främst i domänens strukturella kärna (i gult, figur 3D),medan rester med de minsta icke-linjära koefficienterna mestadels var belägna inom slingor som förbinder de olika strukturella motiven (i blått, figur 3D).
Figur 1:Högtryckscellsmontering och installation i spektrometern. Jag är inte så bra på att säga det här. Den fullständiga högtryckscelluppsättningen kräver ett zirconiarör, en O-ring för engångsbruk, cellbasen (A,B). Röret ansluts till tjuderlinjen genom att åtdragningen av basen till cellen (C,D). 14,7 Nm vridmoment krävs för att förhindra läckage vid lägre tryck. ( E) Zirconiaröret som är anslutet till Xtreme-60-sprutpumpen via tjuderlinjen förs in i spektrometern tills det normala provet har nått sittplats. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Utfällning av hnRNPA1 RRM2-domän under tryck. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Analys av RRM2 toppintensitet och 1H kemikalie flyttar tryckberoende. A)Representativa toppintensitetsprofiler som registrerats för RRM2 mellan 1 och 2 000 bar. Heldragna linjer representerar passformen som erhålls med hjälp av Eq. 1 för att beräkna motsvarande standardförändringar av fri energi och volym i samband med den utfällande reaktionen. B)De översta 25 % av resthalterna med den största uppmätta storleken ΔVU markeras med röda sfärer på RRM2-referensstrukturen (pdb 1U1R). Rester med den minsta storleken på ΔVU visas i grönt. C)Representativa förändringar av 1H kemiska förskjutningar uppmätta för RRM2 mellan 1 bar och 2 000 bar. Heldragna linjer representerar passformen till Eq. 2 för att beräkna de linjära (B1)och icke-linjära (B2)tryckkoefficienterna. D)De översta 25 % av resthalterna med de största B 2-koefficienterna visas i gult, medan de med de minsta B2-koefficienterna visas i blått. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie beskriver ett protokoll som genomförts för att sondera protein strukturella och termodynamik svar på tryck stör. De högtrycksexperiment som registrerats här på RRM2 visar att stora variationer i ΔV U-värden, som tyder på icke-helt kooperativ utveckling, finns i ett relativt litet endomänprotein. En liknande bild framträder från analysen av 1H kemiska skiftförändringar under tryck. Det bör noteras att Kalbitzer och medarbetare har visat att en mer djupgående analys av förändringar i kemiska skiften kan utföras som kopplar förhållandet mellan de icke-linjära och linjära koefficienterna (B2/B1)med förhållandet mellan förändringen i komprimerbarhet och volym (Δβ/ΔV)23. Dessa resultat belyser förmågan hos högt hydrostatiskt tryck att destabilisera enskilda strukturella motiv och underdomäner baserat på den lokala termodynamiska stabiliteten och volymförändringen i samband med utfällning. Att registrera en enkel uppsättning trycktitreringsexperiment kan därför ge värdefull information om vikmekanismer och underdomänarkitektur av ett protein.
Hela trycksystemet (pump och styrenhet) är relativt kompakt och kan installeras på en vanlig bruksvagn för enkel åtkomst till spektrometern (figur 1). Alla pulssekvenser kan användas under tryck utan modifiering, inklusive trippelresonansexperiment. Den enda begränsningen är att tryckklassade zirconiarör minskar känsligheten hos NMR-experiment med nästan 50% jämfört med ett standard NMR-rör med 3 mm diameter. Detta kan innebära en utmaning för proteinprover som inte kan koncentreras till en tillräckligt hög nivå. Jämfört med andra störmetoder som temperatur eller kemiska denatureringsmedel, hydrostatiskt tryck utgör fördelen med att vara, med mycket få undantag, helt reversibla. Eftersom tryck gynnar dissociation av proteinkomplex finns det till exempel mycket liten risk för provaggregering, ett problem som ofta uppstår med höga temperaturer.
Medan hydrostatiskt tryck är ett kraftfullt verktyg för att studera proteinstabilitet, är det viktigt att komma ihåg att det inte finns någon perfekt metod för stör. Var och en av dem belyser specificiteten hos ett proteinfritt energilandskap på ett annat sätt. Till exempel, om två konformations tillstånd har samma molära volym, kommer en ökning av hydrostatiskt tryck inte att väsentligt förändra deras relativa populationer. På samma sätt, om två konformationstillstånd har en liknande exponerad yta, skulle tillsats av kemiska denatureringsmedel inte nödvändigtvis öka den relativa populationen i en stat jämfört med den andra. Helst bör olika störmetoder kombineras för att få en fullständig beskrivning av ett proteinfritt energilandskap15,24. Slutligen bör det noteras att även om manuskriptet är inriktat på tryckberoendet av intensitet och kemiska förskjutningar från serie av 2D 1H-15N-experiment mätta vid jämvikt, kan ett brett spektrum av NMR-experiment kopplas till tryckstörning för att undersöka olika aspekter av stabiliteten, vikmekanismen och den konformationsdynamiken hos proteiner och proteinkomplex20, 25. I artikel 25 i eu 25
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har läst och godkänt manuskriptet. De förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Roy J. Carver Charitable Trust till Julien Roche. Vi tackar J.D. Levengood och B. S. Tolbert för att de vänligen tillhandahåller RRM2-provet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R.
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
