能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成
Summary
ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。
Abstract
カエノハブディティス・エレガンスは、1963年に導入されて以来、生物研究にとって重要なモデルシステムとなっています。しかし、C.エレガンスは、インビトロ転写やDNA複製などの核抽出物を用いた生物学的反応の生化学的研究に十分に利用されていない。生化学的研究でC.エレガンスを使用するための重要なハードルは、核抽出物の活性を犠牲にすることなく、線虫の厚い外側のキューティクルを破壊することです。ドオンス均質化や超音波処理など、キューティクルを壊すためにいくつかの方法が使用されますが、タンパク質の不安定性につながることがよくあります。インビトロ反応のために、活性核タンパク質を幼虫または成人C.エレガンスから単離するための確立されたプロトコルはありません。ここで、プロトコルは、バルチホモジナイザーを用いた幼虫ステージ4 C.エレガンスの均質化について詳細に説明する。バルチホモジナイザーは、圧力を使用して、その過程でキューティクルを壊す狭い隙間からゆっくりと動物を強制します。バルチホモジナイザーの均一な設計および精密な機械化は実験間の動物の一貫した粉砕を可能にする。バルチホモジナイザーから得られたホモジネートを分画すると、C.エレガンスの転写活性をアッセリングするインビトロ法で使用できる機能的に活性な核抽出物を得る。
Introduction
小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学1の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。
線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが得ています。研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または機械的な力を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク質不安定性につながる可能性がある4,5。
C.エレガンスを破るためにDounceホモジナイザーを利用した核抽出分離のための以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルはバルチホモジナイザーを使用しています。Balchホモジナイザーは2つの主要なコンポーネントから成っている:タングステンカーバイドボールと一方の端から別の端に退屈チャネルを持つステンレス鋼のブロック。バルチホモジナイザーはタングステンカーバイドボールを積み込み、粉砕室を密封するために両側にキャップされます。シリンジは、粉砕室につながる2つの垂直ポートに積み込むことができます。材料が一方の注射器からもう一方のシリンジに粉砕室を通って渡されると、注射器からの圧力は、ボールとチャンバーの壁との間の狭い隙間を通って材料を強制します。この遅く、一定の圧力は、それが容易に狭いギャップを通過することができる一貫したサイズに達するまで材料を壊す。一定でありながら穏やかな圧力を介して狭い隙間を通ってC.エレガンスを強制すると、動物が開き、周囲の緩衝液に内容物が放出されます。ボールサイズの切り替えにより、ギャップがさらに引き締まり、新たに放出された細胞が破壊され、核がバッファに解放されます。遠心分離の複数のインスタンスは、細胞の破片の残りの部分から核を分離し、きれいな核抽出物の収集を可能にする。バルチホモジナイザーは、いくつかの理由からDounceホモジナイザーよりも好ましい:システムは、一度の試みで活性タンパク質の大量を抽出することが可能になり、動物の多数を処理することができます。ボールとスチールブロックの精密な加工は、複数のサンプル間で一貫した研削を可能にします。重い鋼ブロックはヒートシンクとして機能し、均一に研削室から熱を引き出し、変性を防ぎます。
単離後、核抽出物の転写活性は、生化学的実験で使用される前に検証する必要があります。従来、転写活性は、新たに合成されたRNAを追跡および可視化するために、放射性標識ヌクレオチドを用いて測定した。しかし、放射性標識は使用時および処分時に注意を要するため、負担が大きくなる可能性があります。技術の進歩により、研究者は定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)7などの技術を用いて、より有害でない、または面倒な方法を使用して、少量のRNA量を測定することができます。ここで、プロトコルは、幼虫期4(L4) C.エレガンス から活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系における転写活性を可視化する方法を説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
C.エレガンス は、その低コストのメンテナンスと遺伝子操作の容易さのために真核生物転写システムを研究する魅力的なモデル生物です。ここでは、L4 C. エレガンス からの機能的に活性な核抽出物を一貫して分離するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは転写活性の可視化に焦点を当てたが、転写後に産生されたcDNAをRT-qPCRを用いて定量化し、転写活性の測定?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH MIRA助成金(J.S.にR35GM124678)によって支えられていました。
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
