Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro
Summary
Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .
Abstract
Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.
Introduction
Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и генетике1. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.
Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток млекопитающих2. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности белка4,5.
В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.
После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и удаления6. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)7. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH MIRA (R35GM124678 для J. S.).
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
