תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות
Summary
עבודות אחרונות לחשוף את ההשפעה העצבית על גליומה ילדים ברמה גבוהה (pHGG) תאים ואינטראקציות הדדיות שלהם. העבודה הנוכחית מראה את ההתפתחות של מודל אין ויטרו פולחן תאי pHGG cohGG נוירונים גלוטמטרגיים ותיעדה את האינטראקציות האלקטרופיזיולוגיות שלהם כדי לחקות את האינטראקטיביות האלה.
Abstract
גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מייצגות סרטן מוח בילדות ובמתבגרים הנושאים פרוגנוזה עגומה מהירה. מכיוון שיש צורך להתגבר על ההתנגדות לטיפולים הנוכחיים ולמצוא דרך חדשה לריפוי, מידול המחלה קרוב ככל האפשר במסגרת מבישה לבדיקת תרופות חדשות והליכים טיפוליים הוא תובעני מאוד. לימוד התהליכים הפתוביולוגיים הבסיסיים שלהם, כולל רגישות יתר של נוירונים גלוטמטרגיים, יהיה התקדמות אמיתית בהבנת אינטראקציות בין המוח הסביבתי לתאי pHGG. לכן, כדי לשחזר נוירונים / אינטראקציות תא pHGG, עבודה זו מראה את ההתפתחות של מודל במבחנה פונקציונלי פולחן שיתוף פולחן גזע Pluripotent המושרה על ידי האדם (hiPS) נגזר נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח pHGG תאים לתוך התקנים microfluidic ממודר ותהליך כדי לתעד את השינויים האלקטרופיזיולוגיים שלהם. הצעד הראשון היה להבדיל ולאפיין נוירונים גלוטמטרגיים אנושיים. שנית, התאים היו בתרבית במכשירים מיקרופלואידיים עם קווי תאים נגזרים pHGG. מיקרו-סביבה מוחית ופעילות עצבית נכללו אז במודל זה כדי לנתח את ההשפעה החשמלית של תאי pHGG על הנוירונים המיקרו-סביבתיים האלה. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מצמידות באמצעות מערכים רב-אלקטרוניים (MEA) למכשירים מיקרופלואידיים אלה כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים ולתעד את הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה. עלייה משמעותית בעירור הנוירונים הודגשה בנוכחות תאים סרטניים.
Introduction
גליומות ילדים ברמה גבוהה (pHGG) מציגות מגוון גנוטיפי ופנוטיפי מורחב בהתאם לגיל המטופל, מיקום גידול אנטומי והרחבה, ונהגים מולקולריים1. הם גידולים אגרסיביים במוח הנשלטים בצורה גרועה עם אפשרויות הטיפול הקיימות כיום והם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן המוח אצל ילדים ומתבגרים2. אז, יותר מ -80% מהחולים מתדרדרים בתוך 2 שנים לאחר האבחון שלהם, וההישרדות החציונית שלהם היא 9-15 חודשים, בהתאם למיקומים במוח ולמוטציות הנהג. היעדר טיפול מרפא הוא הדחף העיקרי למחקר במעבדה ומדגיש את הצורך המיידי בגישות טיפוליות חדשניות חדשות. לשם כך פותחו קווי תאים שמקורם במטופלים (PDCL) בתקווה לספק את מגוון ה-pHGG3 בקווים דו-ממדיים (דו-ממדיים) ו/או נוירוספרות תלת-ממדיות. עם זאת, תרביות תאי ההחמקה שמקורן בחולה אינן מחקות את כל מצבי משתני המוח. מודלים אלה אינם מתייחסים לסביבות הנוירו-אנטומיות המקרוסקופיות והמיקרוסקופיות המתוארות בדרך כלל ב- pHGG.
בדרך כלל, pHGG אצל ילדים צעירים מתפתח בעיקר באזורים פונטין ותלמיים, בעוד HGG של מתבגרים וצעירים להתרכז באזורים קליפת המוח, במיוחד באונה הקדמית1. נראה כי מיקומים ספציפיים אלה בגילאי ילדים כוללים סביבות שונות המובילות לגלומות ורשת מורכבת בין תאים סרטניים ופעילות עצבית ספציפית4,5,6. למרות מנגנונים עדיין לא מזוהים, pHGG מתפתח בעיקר מתאי מבשר עצבי לאורך מסלול הבידול של שושלות אסטרוגליות ואוליגודנדרוגליות. בעוד שתפקידן של שושלות גליה אלה הוגבל במשך זמן רב לתמיכה מבנית פשוטה עבור נוירונים, כעת נקבע בבירור כי הם משתלבים לחלוטין במעגלים עצביים ומציגים אינטראקציות גליה-נוירונית דו-כיווניות מורכבות המסוגלות לארגן מחדש אזורים מבניים במוח ולעצב מחדש מעגלים עצביים4,7,8 . יתר על כן, פיסות הולכות וגדלות של ראיות מצביעות על כך שמערכת העצבים המרכזית (CNS) ממלאת תפקיד קריטי בייזום והתקדמות סרטן המוח. עבודות אחרונות התמקדו בפעילות עצבית, אשר נראה להניע צמיחה ומיטוזה של ממאירות גליה באמצעות גורמי גדילה מופרשים ותקשורת סינפטית אלקטרוכימית ישירה6,9. באופן הדדי, תאי גליומה בדרגה גבוהה נראה להשפיע על תפקוד עצבי עם פעילות עצבית גלוטמטרגית גוברת לווסת את הפעולה של המעגלים שבהם הם משולבים מבנית וחשמלית9. לכן, מחקרים שהשתמשו במודלים שמקורם במטופל ובכלים חדשניים למדעי המוח השולטים בפעולה של נוירונים הדגימו השפעה ספציפית למעגל של פעילות עצבית על מיקום גליומה, צמיחה והתקדמות. רוב התחזיות העצביות המעורבות גליומות הן גלוטמטרגיות ומתקשרות באמצעות הפרשות גלוטמט. סמנים ביולוגיים גלוטמטריים ספציפיים כגון mGluR2 או vGlut1/2 מתוארים בדרך כלל6.
מעניין, למרות ההטרוגניות המולקולרית שלהם, גליומות ילדים ומבוגרים בדרגה גבוהה מראות תגובה נפוצה טיפוסית לפעילות עצבית גלוטמטרגית וגורמים מופרשים אחרים כגון נוירוליגין-3 או BDNF (גורם נוירוטרופי המופק מהמוח)4,6,10,11,12,13 . באזורים קליפת המוח, HGGs ילדים ומבוגרים יכול לגרום hyperexcitability עצבית באמצעות הפרשת גלוטמט מוגברת לעכב אינטראורונים גאבא המוביל gliomas הקשורים לפעילות רשת אפילפטית14,15. נוסף על כך, מעגלים עצביים יכולים להיות משופצים על ידי gliomas דוחף משימות נוירולוגיות ספציפיות, למשל, שפה, והוא יכול לפקיע פעילות עצבית מאורגנת נוספת9.
בהתבסס על רציונל זה, קידום ההבנה של תקשורת דו-כיוונית בין תאי גליומה נוירונים חייב להיות מואר לחלוטין בשילוב עם השלבים המוקדמים של גישות pHGG במבחנה. מידול חדשני כזה חיוני להבנת ומדידת השפעת הפעילות החשמלית העצבית במהלך בדיקות סמים וחיזוי תגובת pHGG למעגלים מוחיים. ההתפתחויות האחרונות בכלי מדעי המוח, כגון מכשירים מיקרופלואידיים ועבודות מחקר pHGG, הן המיטה לפתח גישות מידול חדשות ולהיות מסוגל עכשיו לשלב מיקרו-סביבה במוח במודלים של pHGG במבחנה3,16,17,18,19. יחד עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערכים multielectrode (MEA), התקנים microfluidic20,21,22 מציעים את האפשרות לחקות תנאים פיזיולוגיים תוך רישום הפעילות החשמלית של הרשת העצבית כולה לחלץ פרמטרי קישוריות רשת במספר תנאים. מכשיר זה 23,24 מאפשר תחילה את התצהיר המדויק של תאים בתא ישירות על MEA. טכנולוגיה זו מאפשרת שליטה על צפיפות זריעת תאים והומוגניות על MEA ושליטה עדינה של חילופי מדיה, המהווה צעד קריטי לבידול צאצא עצבי אנושי ישירות למכשירים. יתר על כן, תא התצהיר הנוכחי יכול להיות זרע עם תאים מרובים בנקודות זמן שונות.
לכן, מחקר זה נועד לפתח מודל במבחנה מודל co-culturing גזע Pluripotent אנושי (hiPS) נגזר גלוטמטרגי תאים שמקורם pHGG לתוך מכשירים microfluidic ותיעוד הפעילות החשמלית שלהם כדי להעריך אינטראקציות חשמליות בין שתי אוכלוסיות התא. ראשית, נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח הושגו ואופיינו במכשירים מיקרופלואידיים בשלבים שונים של תרבית [יום 4 (D4), כתאי hiPS, וביום 21 (D21) וביום 23 (D23), כמו נוירונים התבגר גלוטמטרגי]. עבור השלב השני של תרבות משותפת, נעשה שימוש בשני דגמי pHGG: קו UW479 ילדים ממוסחר ותאי pHGG יזם מגידול חולה (BT35)3, נושא מוטציה נהג H3.3 K27M. לבסוף, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תאים גלוטמטרגיים ב- D21 לפני זריעת תאי pHGG ו- D23 לאחר 48 שעות של תרבית משותפת לאותו מכשיר מיקרופלואידי. האינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים לתאי pHGG התאפיינו בעלייה משמעותית בפעילות האלקטרופיזיולוגית המתועדת.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת מודל במבחנה תפקודית מדויקת כדי להעריך את האינטראקציה בין נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח נגזר hiPS אנושי ותאים סרטניים במוח במכשירים מיקרופלואידיים. אחד הצעדים המכריעים בפרוטוקול הנוכחי היה בידול hiPS נוירונים גלוטמטרגיים, אשר אושר על ידי הירידה של כתמים אימונופלואורסצ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית Satt Conectus, Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «פרנק, רון דה סוליי» ו «Semeurs d’Etoile» עמותות. אנו מודים לילדים ולמשפחות שנפגעו מהפגנים על תרומתם למחקר זה ולתמיכתם.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Riferimenti
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex’s lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Ricerca sul cancro. 80 (14), 2979-2982 (2020).
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
