Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas
Summary
Trabalhos recentes revelam o impacto neuronal em células de glioma pediátrico de alto grau (pHGG) e suas interações recíprocas. O presente trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando células pHGG e neurônios glutamatergicos e registrou suas interações eletrofisiológicas para imitar essas interatividades.
Abstract
gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) representam cânceres cerebrais infantis e adolescentes que carregam um rápido prognóstico sombrio. Uma vez que há a necessidade de superar a resistência aos tratamentos atuais e encontrar uma nova forma de cura, modelar a doença o mais próximo possível em um ambiente in vitro para testar novas drogas e procedimentos terapêuticos é altamente exigente. Estudar seus processos patobiológicos fundamentais, incluindo a hiperexcitabilidade do neurônio glutamtergógico, será um verdadeiro avanço na compreensão das interações entre o cérebro ambiental e as células pHGG. Portanto, para recriar as interações de neurônios/células pHGG, este trabalho mostra o desenvolvimento de um modelo in vitro funcional co-culturando tronco pluripotente induzido por humano (hiPS) neurônios glutamatericos derivados pHGG células pHGG em dispositivos microfluidos compartimentalizados e um processo para registrar suas modificações eletrofisiológicas. O primeiro passo foi diferenciar e caracterizar neurônios glutamatericos humanos. Em segundo lugar, as células foram cultivadas em dispositivos microfluidos com linhas celulares derivadas pHGG. O microambiente cerebral e a atividade neuronal foram então incluídos neste modelo para analisar o impacto elétrico das células pHGG nesses neurônios microambientes. Gravações eletrofisiológicas são acopladas usando matrizes multielerodas (MEA) a esses dispositivos microfluidos para imitar condições fisiológicas e registrar a atividade elétrica de toda a rede neural. Um aumento significativo da excitabilidade dos neurônios foi sublinhado na presença de células tumorais.
Introduction
Os gliomas pediátricos de alto grau (pHGG) apresentam uma diversidade genotípica e fenotípica estendida, dependendo da idade do paciente, localização e extensão anatômicas do tumor e drivers moleculares1. São tumores cerebrais agressivos que são mal controlados com as opções de tratamento disponíveis atualmente e são a principal causa de morte relacionada a cânceres cerebrais em crianças e adolescentes2. Assim, mais de 80% dos pacientes estão recaídas dentro de 2 anos após seu diagnóstico, e sua sobrevida mediana é de 9 a 15 meses, dependendo das localizações cerebrais e mutações do motorista. A ausência de tratamento curativo é o principal impulso para pesquisas laboratoriais e destaca a necessidade imediata de novas abordagens terapêuticas inovadoras. Para isso, as linhas celulares derivadas do paciente (PDCL) foram desenvolvidas com a esperança de fornecer a diversidade pHGG3 em linhas bidimensionais (2D) e/ou neuroesferas tridimensionais (3D). No entanto, essas culturas celulares in vitro derivadas do paciente não imitam todas as situações variáveis cerebrais. Esses modelos não consideram os ambientes neuroscópicos e microscópicos macroscópicos tipicamente descritos no pHGG.
Normalmente, o pHGG em crianças mais jovens está se desenvolvendo principalmente em regiões pontinas e talámicas, enquanto o HGG de adolescentes e jovens adultos se concentra nas áreas corticais, especialmente nos lobos frontotemporâneos1. Essas especificidades de localização em idades pediátricas parecem envolver diferentes ambientes que levam à gliomagênese e a uma rede metiço entre células tumorais e atividade neuronal específica4,5,6. Embora os mecanismos ainda não sejam identificados, o pHGG desenvolve-se principalmente a partir de células precursoras neurais ao longo da trajetória de diferenciação das linhagens astroglial e oligodendroglial. Embora o papel dessas linhagens gliais tenha sido por muito tempo restrito ao simples suporte estrutural para os neurônios, agora está claramente estabelecido que eles se integram inteiramente em circuitos neurais e exibem complexas interações gliais-neuronais complexas capazes de reorganizar regiões estruturais do cérebro e remodelar circuitos neuronais4,7,8 . Além disso, o aumento de fragmentos de evidências indica que o sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel crítico na iniciação e progressão do câncer cerebral. Trabalhos recentes se concentraram na atividade neuronal, que parece impulsionar o crescimento e a mitose das malignidades gliais através de fatores de crescimento secretados e comunicações sinápticas eletroquímicas diretas6,9. Reciprocamente, as células de glioma de alto grau parecem influenciar a função neuronal com uma atividade neuronal glutamatergic crescente e modular o funcionamento dos circuitos nos quais estão estruturalmente e eletricamente integrados9. Assim, estudos usando modelos derivados do paciente e novas ferramentas de neurociência que controlam a ação dos neurônios demonstraram um efeito específico do circuito da atividade neuronal na localização, crescimento e progressão do glioma. A maioria dessas projeções neuronais envolvidas em gliomas são glutamatergicas e se comunicam através de secreções de glutamato. Biomarcadores glutamérgicos específicos, como mGluR2 ou vGlut1/2, são comumente descritos6.
Curiosamente, apesar de sua heterogeneidade molecular, gliomas pediátricos e adultos de alto grau mostram uma resposta proliferativa típica à atividade neuronal glutamatergica e outros fatores secretados como neuroligina-3 ou BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro)4,6,10,11,12,13 . Nas regiões corticais, os HGGs pediátricos e adultos podem induzir a hiperexcitabilidade neuronal através de uma secreção de glutamato aumentada e inibir interneurônios GABA que levam a gliomas associados à atividade da rede epiléptica14,15. Além disso, circuitos neurais podem ser remodelados por gliomas empurrando tarefas neurológicas específicas, por exemplo, linguagem, e podem requisitar atividades neuronais organizadas adicionais9.
Com base nessa lógica, o avanço da compreensão das comunicações bidirecionais entre células glioma e neurônios deve ser totalmente elucidado e integrado com os estágios iniciais das abordagens in vitro pHGG. Tal modelagem inovadora é crucial para entender e medir o impacto da atividade elétrica neuronal durante o teste de drogas e antecipar a resposta do PHGG em circuitos cerebrais. Desenvolvimentos recentes em ferramentas de neurociência, como dispositivos microfluidos e trabalhos de pesquisa pHGG, são o leito para desenvolver novas abordagens de modelagem e agora ser capaz de integrar o microambiente cerebral em modelos in vitro pHGG3,16,17,18,19. Juntamente com gravações eletrofisiológicas usando matrizes multieletrônicas (MEA), dispositivos microfluidos20,21,22 oferecem a possibilidade de imitar condições fisiológicas ao registrar a atividade elétrica de toda a rede neural e extrair parâmetros de conectividade de rede em várias condições. Este dispositivo23,24 permite primeiro a deposição precisa de células em uma câmara diretamente no MEA. Esta tecnologia permite o controle da densidade de semeadura celular e homogeneidade no MEA e o controle fino da troca de mídia, que é um passo crítico para a diferenciação de progenitores neurais humanos diretamente em dispositivos. Além disso, a atual câmara de deposição pode ser semeada com múltiplas células em diferentes pontos de tempo.
Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo in vitro funcional co-culminando neurônios glutamatergicos derivados do padrão pluripotente (hiPS) derivados de neurônios glutamatergicos derivados e células derivadas do pHGG em dispositivos microfluidos e registrando sua atividade elétrica para avaliar interações elétricas entre ambas as populações celulares. Primeiro, os neurônios glutamatericos cortical derivados do hiPS foram obtidos e caracterizados em dispositivos microfluidos em diferentes estágios da cultura [dia 4 (D4), como células hiPS, e dia 21 (D21) e dia 23 (D23), como neurônios amadurecidos glutamater]. Para a segunda etapa da cocultura, foram utilizados dois modelos pHGG: a linha UW479 pediátrica comercializada e as células pHGG iniciadas a partir de um tumor do paciente (BT35)3, com uma mutação do driver H3.3 K27M. Finalmente, realizamos gravações eletrofisiológicas de células glutamatergicas em D21 antes da semeadura celular pHGG e D23 após 48 h de co-cultura no mesmo dispositivo microfluido. As interações entre neurônios glutamatergicos e células pHGG foram caracterizadas por um aumento significativo na atividade eletrofisiológica registrada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve um modelo in vitro funcional preciso para avaliar a interação entre neurônios glutamatergicos cortical derivados do hiPS humano e células tumorais cerebrais em dispositivos microfluidos. Um dos passos cruciais no presente protocolo foi a diferenciação hiPS em neurônios glutamatericos, o que foi confirmado pela diminuição da coloração imunofluorescente Nestin e Sox2 e aparência simultânea da coloração mGluR2 e vGLUT1. No entanto, poucos progenitores neurais permaneceram como …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa Satt Conectus, Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», “Franck, Rayon de Soleil” e “Semeurs d’Etoile”. Agradecemos às crianças e famílias afetadas pelos HGGs por suas contribuições para esta pesquisa e seu apoio.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Riferimenti
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