Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques
Summary
Des travaux récents révèlent l’impact neuronal sur les cellules de gliome pédiatrique de haut grade (pHGG) et leurs interactions réciproques. Les présents travaux montrent le développement d’un modèle in vitro co-cultivant des cellules pHGG et des neurones glutamatergiques et ont enregistré leurs interactions électrophysiologiques pour imiter ces interactivités.
Abstract
Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) représentent des cancers du cerveau chez l’enfant et l’adolescent qui entraînent un pronostic lugubre rapide. Puisqu’il est nécessaire de surmonter la résistance aux traitements actuels et de trouver une nouvelle façon de guérir, modéliser la maladie aussi près que possible dans un cadre in vitro pour tester de nouveaux médicaments et procédures thérapeutiques est très exigeant. L’étude de leurs processus pathobiologiques fondamentaux, y compris l’hyperexcitabilité des neurones glutamatergiques, constituera une véritable avancée dans la compréhension des interactions entre le cerveau environnemental et les cellules pHGG. Par conséquent, pour recréer les interactions neurones/cellules pHGG, ce travail montre le développement d’un modèle in vitro fonctionnel co-cultivant des neurones corticaux glutamatergiques dérivés de la tige pluripotente induite par l’homme (hiPS) dans des cellules pHGG corticales en dispositifs microfluidiques compartimentés et un processus pour enregistrer leurs modifications électrophysiologiques. La première étape consistait à différencier et à caractériser les neurones glutamatergiques humains. Deuxièmement, les cellules ont été cultivées dans des dispositifs microfluidiques avec des lignées cellulaires dérivées de pHGG. Le microenvironnement cérébral et l’activité neuronale ont ensuite été inclus dans ce modèle pour analyser l’impact électrique des cellules pHGG sur ces neurones micro-environnementaux. Les enregistrements électrophysiologiques sont couplés à l’aide de réseaux multiélectrodes (MEA) à ces dispositifs microfluidiques pour imiter les conditions physiologiques et enregistrer l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal. Une augmentation significative de l’excitabilité des neurones a été soulignée en présence de cellules tumorales.
Introduction
Les gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) présentent une diversité génotypique et phénotypique étendue en fonction de l’âge du patient, de l’emplacement et de l’extension anatomiques de la tumeur et des facteurs moléculaires1. Ce sont des tumeurs cérébrales agressives qui sont mal contrôlées avec les options de traitement actuellement disponibles et sont la principale cause de décès liés aux cancers du cerveau chez les enfants et les adolescents2. Ainsi, plus de 80% des patients rechutent dans les 2 ans suivant leur diagnostic, et leur survie médiane est de 9 à 15 mois, en fonction de l’emplacement du cerveau et des mutations du conducteur. L’absence de traitement curatif est la principale raison d’être de la recherche en laboratoire et souligne le besoin immédiat de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. À cette fin, des lignées cellulaires dérivées de patients (PDCL) ont été développées dans l’espoir de fournir la diversité pHGG3 dans des lignées bidimensionnelles (2D) et / ou des neurosphères tridimensionnelles (3D). Néanmoins, ces cultures cellulaires in vitro dérivées de patients n’imitent pas toutes les situations de variables cérébrales. Ces modèles ne tiennent pas compte des environnements neuro-anatomiques macroscopiques et microscopiques généralement décrits dans pHGG.
Habituellement, le pHGG chez les jeunes enfants se développe principalement dans les régions pontine et thalamique, tandis que le HGG de l’adolescent et du jeune adulte se concentre dans les zones corticales, en particulier dans les lobes frontotemporaux1. Ces spécificités de localisation à travers les âges pédiatriques semblent impliquer différents environnements conduisant à la gliomagenèse et à un réseau d’intrication entre les cellules tumorales et l’activité neuronale spécifique4,5,6. Bien que les mécanismes ne soient pas encore identifiés, le pHGG se développe principalement à partir de cellules précurseurs neurales le long de la trajectoire de différenciation des lignées astrogliales et oligodendrogliales. Alors que le rôle de ces lignées gliales a longtemps été limité à un simple soutien structurel des neurones, il est maintenant clairement établi qu’elles s’intègrent entièrement dans les circuits neuronaux et présentent des interactions gliales-neuronales bidirectionnelles complexes capables de réorganiser les régions structurelles du cerveau et de remodeler les circuits neuronaux4,7,8 . De plus, de plus en plus de preuves indiquent que le système nerveux central (SNC) joue un rôle essentiel dans l’initiation et la progression du cancer du cerveau. Des travaux récents se sont concentrés sur l’activité neuronale, qui semble stimuler la croissance et la mitose des tumeurs malignes gliales par le biais de facteurs de croissance sécrétés et de communications synaptiques électrochimiques directes6,9. Réciproquement, les cellules de gliome de haut grade semblent influencer la fonction neuronale avec une activité neuronale glutamatergique croissante et moduler le fonctionnement des circuits dans lesquels elles sont structurellement et électriquement intégrées9. Ainsi, des études utilisant des modèles dérivés de patients et de nouveaux outils de neurosciences contrôlant l’action des neurones ont démontré un effet spécifique au circuit de l’activité neuronale sur la localisation, la croissance et la progression du gliome. La plupart de ces projections neuronales impliquées dans les gliomes sont glutamatergiques et communiquent par le biais des sécrétions de glutamate. Des biomarqueurs glutamatergiques spécifiques tels que mGluR2 ou vGlut1/2 sont couramment décrits6.
Fait intéressant, malgré leur hétérogénéité moléculaire, les gliomes pédiatriques et adultes de haut grade montrent une réponse proliférative typique à l’activité neuronale glutamatergique et à d’autres facteurs sécrétés tels que la neuroligine-3 ou le BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau)4,6,10,11,12,13 . Dans les régions corticales, les HHG pédiatriques et adultes peuvent induire une hyperexcitabilité neuronale par une augmentation de la sécrétion de glutamate et inhiber les interneurones GABA conduisant à des gliomes associés à l’activité du réseau épileptique14,15. En plus de cela, les circuits neuronaux peuvent être remodelés par des gliomes poussant des tâches neurologiques spécifiques, par exemple le langage, et peuvent réquisitionner une activité neuronale organisée supplémentaire9.
Sur la base de cette logique, l’avancement de la compréhension des communications bidirectionnelles entre les cellules de gliome et les neurones doit être entièrement élucidé et intégré aux premiers stades des approches pHGG in vitro. Une telle modélisation innovante est cruciale pour comprendre et mesurer l’impact de l’activité électrique neuronale lors des tests de drogue et anticiper la réponse pHGG dans les circuits cérébraux. Les développements récents dans les outils de neurosciences, tels que les dispositifs microfluidiques et les travaux de recherche pHGG, sont le lit pour développer de nouvelles approches de modélisation et être maintenant en mesure d’intégrer le microenvironnement cérébral dans des modèles pHGG in vitro3,16,17,18,19. Couplés à des enregistrements électrophysiologiques utilisant des réseaux multiélectrodes (MEA), les dispositifs microfluidiques20,21,22 offrent la possibilité d’imiter les conditions physiologiques tout en enregistrant l’activité électrique de l’ensemble du réseau neuronal et d’extraire les paramètres de connectivité réseau dans plusieurs conditions. Ce dispositif23,24 permet d’abord le dépôt précis de cellules dans une chambre directement sur MEA. Cette technologie permet le contrôle de la densité et de l’homogénéité de l’ensemencement cellulaire sur MEA et le contrôle fin de l’échange de milieux, ce qui est une étape critique pour la différenciation des progéniteurs neuronaux humains directement dans les dispositifs. De plus, la chambre de dépôt actuelle peut être ensemencée avec plusieurs cellules à différents moments.
Ainsi, cette étude visait à développer un modèle fonctionnel in vitro co-cultivant des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de la tige pluripotente humaine (hiPS) et des cellules dérivées de pHGG dans des dispositifs microfluidiques et enregistrant leur activité électrique pour évaluer les interactions électriques entre les deux populations cellulaires. Tout d’abord, des neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS ont été obtenus et caractérisés dans des dispositifs microfluidiques à différents stades de culture [jour 4 (D4), en tant que cellules hiPS, et jour 21 (D21) et jour 23 (D23), en tant que neurones matures glutamatergiques]. Pour la deuxième étape de la co-culture, deux modèles pHGG ont été utilisés : la lignée pédiatrique UW479 commercialisée et les cellules pHGG initiées à partir d’une tumeur patiente (BT35)3, porteuses d’une mutation pilote H3.3 K27M. Enfin, nous avons effectué des enregistrements électrophysiologiques de cellules glutamatergiques à D21 avant l’ensemencement des cellules pHGG et D23 après 48 h de co-culture dans le même dispositif microfluidique. Les interactions entre les neurones glutamatergiques et les cellules pHGG ont été caractérisées par une augmentation significative de l’activité électrophysiologique enregistrée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail décrit un modèle fonctionnel in vitro précis pour évaluer l’interaction entre les neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPS humains et les cellules tumorales cérébrales dans des dispositifs microfluidiques. L’une des étapes cruciales du présent protocole était la différenciation hiPS dans les neurones glutamatergiques, qui a été confirmée par la diminution de la coloration immunofluorescente Nestin et Sox2 et l’apparition simultanée de la coloration mGluR2 et vGLUT1. N?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du programme Satt Conectus, de la Fondation de l’Université de Strasbourg, des associations « J’ai demandé la lune », « Une roulade pour Charline », « LifePink », « Franck, Rayon de Soleil » et « Semeurs d’Etoile ». Nous remercions les enfants et les familles touchés par les GHG pour leur contribution à cette recherche et leur soutien.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Riferimenti
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex’s lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Ricerca sul cancro. 80 (14), 2979-2982 (2020).
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
