ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי
Summary
שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.
Abstract
יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולכומת את ספיגת ההדבקה החוץ-תאית (EV) של התאים. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית בתחומי מחקר שונים; ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח, ואספקת תרופות. ספרות דיווחו על ספיגת EV רבים; עם זאת, קיים חוסר במתודולוגיה ניסיונית מעשית ומפורטת. ניתן להעריך את ספיגת EV על ידי תיוג פלואורסצנטי של EVs כדי לזהות את מיקומם בתוך התאים. קשה להבחין בין EVs מופנמים בתאים לבין ה-EVs השטחיים בתאים, אך קריטיים, כדי לקבוע במדויק את ספיגת EV. לכן, בדיקה כי ביעילות כימות ספיגת EV באמצעות תלת מימדי (3D) פלואורסצנטיות קונפוקלית מיקרוסקופיה מוצעת בעבודה זו. כלי עבודה אלקטרוניים בעלי תווית פלואורסצנטית הוכנו באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון, שנודע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית, ולאחר מכן נותחו באמצעות תוכנה מתקדמת לעיבוד תמונה. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית וגישה מעשית לניתוח יעיל.
Introduction
שלשולים חוץ-תאיים (EVs) הם חלקיקים ננו-בגודל ננו, הקשורים לקרום השומנים המסווגים לפי גודלם: אקטוזומים (100-500 ננומטר) ואקסוזומים (50-150 ננומטר)1. רכבים יפים מכילים ביומולקולים שונים, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. ביומולקולים אלה מקורם בתאים לפני שהם עטופים כמטען ומשוחררים לחלל החוץ-תאי באמצעות EVs1,2,3.
בשל מגוון המטען שלהם, רכבים חשמליים הם האמינו לשחק תפקיד פעיל בתקשורת בין תאית. שחרור וספיגה של רכבים ותשובים על ידי תאים מאפשרים העברה של biomolecules בין התאים4,5. כניסת מטען EV לתא עשויה לשנות את הפונקציות של תא הנמען ואת המצב ההומיאוסטטי4,5,6. כלי ינוי מופנמים באמצעות מסלולים מרובים; עם זאת, המנגנונים המדויקים לא הוכחו במדויק.
רוב בדיקות ספיגת EV, כגון תיוג גנטי, תווית פלואורסצנטית EVs7 בודדים. האות המתקבל יכול להימדד על ידי פוטומטר מיקרו-לוחית, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה, כאשר לכל טכנולוגיה יש מגבלות משמעותיות. מיקרו-לוח צילום, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה דו-ממדית סטנדרטית (דו-ממדית) אינם יכולים להבחין בין EVs8,9 מופנם ומוצמד באופן שטחי. בנוסף, הכנת המדגם הדרושה לכל אחת מהטכניקות הללו עשויה להכניס בעיות נוספות להערכת ספיגת EV. לדוגמה, הרמת תאים דבוקים עם טריפסין לפני ניתוח ספיגת EV עשויה לבקע כמה EVs מחוברים באופן שטחי על פני השטח של התא10,11. טריפסין עשוי גם לקיים אינטראקציה עם פני השטח של התא, המשפיעים על פנוטיפ התא ו- EV. בנוסף, טריפסין לא יכול לנתק EVs שטחי לחלוטין, מוטה אוכלוסיות מבודדות.
כדי לסמן במדויק את ה-EVs בצבעים פלואורסצנטיים, נדרשים שלבי כביסה נוספים כדי להסיר את שאריות הצבע7. טכניקות בידוד מקובלות יכולות גם לתרום לאותות חיוביים כוזבים עקב קרישה המתרחשת במהלך בידוד EV. לדוגמה, אולטרה-צנטריפוגה טורית (UC) נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד רכבים אופן אלקטרוני ולהסיר את הצבע משותק. עם זאת, UC עשוי לזרז את ה- EVs, והצבע השיורי עלול להוביל לאות חיובי כוזב12,13. שיטות ננו-סינון אחרות, כגון סינון מבוסס טורים, נמצאות בשימוש נרחב גם להסרת צבע לא משותק. האופי המורכב של רכבים EVs וצבע אינטראקציה בתוך מטריצת העמודה עלול להוביל הסרה חלקית של צבע שיורית עקב החתך המולקולרי של העמודה משתנה על ידי קלט מורכב14,15,16.
הפרוטוקול הנוכחי מציע מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון כדי לבודד ולשטוף EVscented שכותרתו פלואורסצנטית מבודדת. ההתקן המיקרו-פלוידי מבוסס ננו-סינון יכול לספק סינון יעיל באמצעות טכנולוגיית הפרדה בסיוע נוזלים (FAST)17,18. FAST מפחית את ירידת הלחץ על-פני המסנן, ובכך מפחית את הצבירה הפוטנציאלית בין הרכבים החמוצים והצבעים. על ידי הסרת שיורי צבע ביעילות, ניתן לשפר את האיכות של EVs שכותרת פלואורסצנטית ואת הספציפיות של ה- assay.
מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להבחין בין EVs מופנם ושטחי מחובר על פני התא ולחקור באופן מקיף את המנגנונים התאיים של ספיגת EV ברזולוציה spatiotemporal19,20,21,22,23,24,25. לדוגמה, סונג ואח ‘ תיארו את ההדמיה של מחזור החיים האקסויזום באמצעות כתב התא החי המפותח שלהם. המיקום של כלי העבודה האלקטרוניים שהופנמו זוהה ונותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בכלי עיבוד תלת-ממדיים (3D) ופוסט-תמונה20. למרות שגודלם של כלי הרכב האלקטרוניים הקטנים (40-200 ננומטר) נמוך ממגבלת הרזולוציה של המיקרוסקופ האופטי, ניתן לזהות את הרכבים האלקטרוניים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מכיוון שצלם הצילום יכול לזהות את פליטת הפלואורסצנטיות המשופרת. לכן, לוקליזציה תת-תאית של EVs פלואורסצנטית בתוך תא ניתן לקבוע במדויק על ידי רכישת תמונות z-stacked מרובים של EVs ואת organelles הסלולר שמסביב.
בנוסף, שחזור תלת-ממד ועיבוד לאחר נתונים יכולים לספק תובנה נוספת לגבי המיקום של הרובוטים האלקטרוניים המופנמים, השטחיים והצפים בחינם. על ידי ניצול תהליכים אלה בשילוב עם הדמיית תאים חיים בזמן לשגות המוצעת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להעריך במדויק את רמת ספיגת EV, ואת המעקב בזמן אמת של ספיגת EV אפשרי גם. יתר על כן, ניתוח סחר EV יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על ידי הערכת לוקליזציה משותפת של רכבים אופניים עם אברונים, צעד ראשון כדי לקבוע כיצד EVs מופנמים מעורבים בפונקציה התארית. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לביצוע בדיקת ספיגת EV באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון17,26, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח לאחר התמונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת ספיגת EV המבוססת על הדמיית פלואורסצנטיות תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת מתודולוגיה יעילה וניתוח רגיש. תיוג EV פלואורסצנטי זה מקל על הדמיה של EVs ומבצע בהצלחה בדיקה מדויקת של ספיגת EV. שיטות קודמות לתיוג EVs והסרת הצבע שיורית דווחו על ידי הסרת משקעים באמצעות ultracentrifugation…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NCI מענק nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 ו- CA143055 ל- K. J. P. מחקר זה נתמך על ידי מענק של פרויקט מו”פ טכנולוגיית הבריאות של קוריאה באמצעות המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI), במימון משרד הבריאות והרווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר מענק: HI19C1122). עבודה של ג’יי קים וי-קיי. צ’ו נתמך על ידי המכון למדע בסיסי (IBS-R020-D1), במימון ממשלת קוריאה. המחברים מודים לחברי המכון האורולוגי הנוכחי והעבר של המכון האורולוגי בריידי, במיוחד חברי המעבדה פינטה-תיקון, על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
Riferimenti
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
