Анализ поглощения внеклеточных везикул с помощью конфокального микроскопического анализа изображений
Summary
Внеклеточные везикулы (EV) способствуют клеточной биологии и межклеточной связи. Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения EV клетками. Текущий протокол предлагает анализ поглощения EV с использованием трехмерной флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии после изоляции EV микрофлюидным устройством на основе нанофильтрации.
Abstract
Существует необходимость в практических анализах для визуализации и количественной оценки поглощения внеклеточных везикул (EV) клетками. Поглощение электромобилей играет роль в межклеточной коммуникации в различных областях исследований; биология рака, неврология и доставка лекарств. В литературе сообщалось о многих анализах поглощения электромобилей; однако отсутствует практическая, подробная экспериментальная методология. Поглощение ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть оценено путем флуоресцентной маркировки электромобилей для определения их местоположения в клетках. Различение интернализованных EV в клетках и поверхностных EV на клетках трудно, но важно точно определить поглощение EV. Поэтому в этой работе предлагается анализ, который эффективно количественно определяет поглощение электромобилей с помощью трехмерной (3D) флуоресцентной конфокальной микроскопии. Флуоресцентно меченые электромобили были подготовлены с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, визуализированного с помощью 3D-конфокальной микроскопии, а затем проанализированного с помощью передового программного обеспечения для обработки изображений. Протокол обеспечивает надежную методологию анализа электромобилей на клеточном уровне и практический подход для эффективного анализа.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой наноразмерные, связанные с липидной мембраной частицы, которые классифицируются по их размерам: эктосомы (100-500 нм) и экзосомы (50-150 нм)1. ЭЛЕКТРОМОБИЛИ содержат различные биомолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Эти биомолекулы происходят из клеток, прежде чем быть инкапсулированными в качестве груза и выпущены во внеклеточное пространство через EV1,2,3.
Из-за разнообразия их груза электромобили, как полагают, играют активную роль в межклеточной связи. Высвобождение и поглощение ЭВ клетками позволяет передавать биомолекулы между клетками4,5. Введение EV-груза в клетку может изменить функции клетки-реципиента и гомеостатическое состояние4,5,6. Электромобили интернализуются несколькими путями; однако точные механизмы не были точно продемонстрированы.
Большинство анализов поглощения электромобилей, таких как генетическая маркировка, флуоресцентно маркируют отдельные EV7. Результирующий сигнал может быть измерен с помощью микропластинчатого фотометра, проточной цитометрии или микроскопии, причем каждая технология имеет существенные ограничения. Микропластинчатые фотометры, проточная цитометрия или стандартная двумерная (2D) микроскопия не могут различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV8,9. Кроме того, необходимая пробоподготовка для каждого из этих методов может внести дополнительные проблемы в оценку поглощения EV. Например, подъем прилипших клеток трипсином перед анализом поглощения EV может расщеплять некоторые поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки10,11. Трипсин может также взаимодействовать с поверхностью клетки, влияя на клетку и фенотип EV. Кроме того, трипсин может не отделять поверхностные EV полностью, искажая изолированные популяции.
Чтобы точно маркировать электромобили флуоресцентными красителями, для удаления остаточного красителя7 требуются дополнительные этапы промывки. Принятые методы изоляции также могут способствовать ложноположительным сигналам из-за коагуляции, которая происходит во время изоляции EV. Например, последовательное ультрацентрифугирование (UC) широко используется для изоляции электромобилей и удаления обездвиженного красителя. Однако UC может со-осаждение EV, а остаточный краситель может привести к ложноположительному сигналу12,13. Другие методы нанофильтрации, такие как колонная фильтрация, также широко используются для удаления неиммобилизованных красителей. Сложный характер взаимодействия EV и красителя в матрице колонны может привести к неполному удалению остаточного красителя из-за изменения молекулярной отсечки колонны комплексным входом14,15,16.
Текущий протокол предлагает микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации для выделения и промывки флуоресцентно меченых изолированных электромобилей. Микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации может обеспечить эффективную фильтрацию с помощью технологии разделения с помощью жидкости (FAST)17,18. FAST уменьшает падение давления в фильтре, тем самым уменьшая потенциальную агрегацию между электромобилями и красителями. Эффективно удаляя остаточный краситель, можно повысить качество флуоресцентно маркированных электромобилей и специфичность анализа.
Конфокальная микроскопия может различать интернализованные и поверхностно прикрепленные EV на поверхности клетки и всесторонне исследовать клеточные механизмы поглощения EV в пространственно-временном разрешении19,20,21,22,23,24,25. Например, Sung et al. описали визуализацию жизненного цикла экзосом с использованием своего разработанного репортера живых клеток. Местоположение интернализованных электромобилей было обнаружено и проанализировано с помощью конфокального микроскопа в трехмерных (3D) и пост-изображениях20. Хотя размер небольших электромобилей (40-200 нм) ниже предела разрешения оптического микроскопа, флуоресцентно меченые электромобили могут быть обнаружены с помощью конфокальной микроскопии, поскольку фотоприемник может обнаруживать усиленное флуоресцентное излучение. Таким образом, субклеточная локализация флуоресцентно меченых EV внутри клетки может быть точно определена путем получения нескольких z-образных изображений EV и окружающих клеточных органелл.
Кроме того, 3D-реконструкция и пост-обработка данных могут обеспечить дальнейшее понимание позиционирования интернализованных, поверхностных и свободно плавающих электромобилей. Используя эти процессы в сочетании с покадровой визуализацией живых клеток, предлагаемой конфокальной микроскопией, уровень поглощения EV может быть точно оценен, а также возможно отслеживание поглощения EV в режиме реального времени. Кроме того, анализ трафика ЭЛЕКТРОМОБИЛей может быть выполнен с использованием конфокальной микроскопии путем оценки совместной локализации EV с органеллами, что является первым шагом для определения того, как интернализованные EV участвуют во внутриклеточной функции. Этот протокол описывает методологию выполнения анализа поглощения EV с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации17,26, конфокальной микроскопии и анализа после изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ поглощения электромобилей, основанный на 3D-флуоресцентной визуализации с помощью конфокальной микроскопии, обеспечивает эффективную методологию и чувствительный анализ. Эта флуоресцентная маркировка EV облегчает визуализацию электромобилей и успешно выполняет точный а?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NCI nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 и CA143055 к K. J. P. Это исследование было поддержано грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемый Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (номер гранта: HI19C1122). Работы Д. Кима и Ю.-К. Чо был поддержан Институтом фундаментальных наук (IBS-R020-D1), финансируемым корейским правительством. Авторы благодарят нынешних и бывших членов Урологического института Брейди, особенно сотрудников лаборатории Pienta-Amend, за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
Riferimenti
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
