Extracellulär vesicle uptake assay via confocal mikroskop imaging analys
Summary
Extracellulära blåsor (EVs) bidrar till cellulär biologi och intercellulär kommunikation. Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera EVs-upptag av cellerna. Det nuvarande protokollet föreslår EV-upptagsanalysen genom att använda tredimensionell fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, efter EV-isolering av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet.
Abstract
Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera cellernas extracellulära vesikel (EV) upptag. Ev-upptagning spelar en roll i intercellulär kommunikation inom olika forskningsområden; cancerbiologi, neurovetenskap och läkemedelsleverans. Många EV upptag analyser har rapporterats i litteraturen; Det saknas dock praktisk, detaljerad experimentell metodik. EV-upptag kan bedömas genom att fluorescerande märka EVs för att upptäcka deras plats i celler. Att skilja mellan internaliserade EVs i celler och de ytliga EVs på celler är svårt, men ändå kritiskt, att exakt bestämma EV-upptaget. Därför föreslås en analys som effektivt kvantifierar EV-upptag genom tredimensionell (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i detta arbete. Fluorescerande märkta EVs förbereddes med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet, visualiserad av 3D-konfokal mikroskopi och analyserades sedan genom avancerad bildbehandlingsprogramvara. Protokollet ger en robust metodik för att analysera EVs på cellnivå och ett praktiskt tillvägagångssätt för effektiv analys.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är nanostora, lipidmembranbundna partiklar som kategoriseras efter deras storlekar: ectosomer (100-500 nm) och exosomer (50-150 nm)1. EVs innehåller olika biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyror och lipider. Dessa biomolekyler härstammar från cellerna innan de kapslas in som last och släpps ut i det extracellulära utrymmet via EVs1,2,3.
På grund av mångfalden av deras last tros EVs spela en aktiv roll i intercellulär kommunikation. Utsättning och användning av EVs av celler möjliggör överföring av biomolekyler mellan cellerna4,5. Införandet av EV-last i en cell kan ändra mottagarcellens funktioner och homeostatiska tillstånd4,5,6. EVs internaliseras genom flera vägar; De exakta mekanismerna har dock inte visats korrekt.
Majoriteten av EV-upptagsanalyser, såsom genetisk märkning, märker fluorescerande enskilda EVs7. Den resulterande signalen kan mätas med mikroplate-fotometer, flödescytometri eller mikroskopi, där varje teknik har betydande begränsningar. Mikroplate-fotometrar, flödescytometri eller standard tvådimensionell (2D) mikroskopi kan inte skilja mellan internaliserad och ytligt fäst EVs8,9. Dessutom kan den nödvändiga provberedningen för var och en av dessa tekniker medföra ytterligare problem i utvärderingen av upptagningen av ev. Till exempel kan lyft av vidhäftade celler med trypsin före EV-upptagsanalys klyva några ytligt fästa EVs på cellens yta10,11. Trypsin kan också interagera med cellytan, vilket påverkar cell- och EV-fenotyp. Dessutom kan trypsin inte lossa ytliga EVs helt och hållet, skeva isolerade populationer.
För att noggrant märka EL med fluorescerande färgämnen krävs ytterligare tvättsteg för att ta bort restfärgen7. Accepterade isoleringstekniker kan också bidra till falskt positiva signaler på grund av koagulering som uppstår under EV-isolering. Till exempel används seriell ultracentrifugation (UC) ofta för att isolera EVs och ta bort det immobiliserade färgämnet. UC kan dock fälla ut EVs tillsammans, och restfärgen kan leda till en falskt positiv signal12,13. Andra nanofiltreringsmetoder, såsom kolumnbaserad filtrering, används också ofta för icke-immobiliserad färgborttagning. Den komplexa karaktären hos EVs och färgämne som interagerar inom kolonnmatrisen kan leda till ofullständigt avlägsnande av restfärg på grund av att kolonnens molekylära avskärning ändras av den komplexa indata14,15,16.
Det nuvarande protokollet föreslår en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet för att isolera och tvätta fluorescerande märkta isolerade EVs. Den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten kan ge effektiv filtrering via vätskeassisterad separationsteknik (FAST)17,18. FAST minskar tryckfallet över filtret, vilket minskar den potentiella aggregeringen mellan EVs och färgämnen. Genom att effektivt avlägsna restfärg är det möjligt att förbättra kvaliteten på fluorescerande märkta EVs och analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skilja mellan internaliserade och ytligt fästa EVs på cellytan och grundligt undersöka cellulära mekanismerna för EV-upptag i en spatiotemporal upplösning19,20,21,22,23,24,25. Till exempel beskrev Sung et al. visualiseringen av exosomlivscykeln med hjälp av deras utvecklade live-cell reporter. Platsen för de internaliserade EVs upptäcktes och analyserades med hjälp av ett konfokalt mikroskop i tredimension (3D) och efterbild bearbetningsverktyg20. Även om storleken på små EL (40-200 nm) ligger under upplösningsgränsen för det optiska mikroskopet, kan de fluorescerande märkta EVs detekteras av konfokal mikroskopi eftersom fotodetektorn kan upptäcka det förbättrade fluorescensutsläppet. Därför kan subcellulär lokalisering av fluorescerande märkta EVs i en cell exakt bestämmas genom att förvärva flera z-staplade bilder av EVs och de omgivande cellulära organellerna.
Dessutom kan 3D-rekonstruktion och efterdatabehandling ge ytterligare insikt i positionering av internaliserade, ytliga och fritt flytande EVs. Genom att använda dessa processer i samband med den tidsfördröjning live-cell imaging som erbjuds av konfokal mikroskopi, nivån av EV-upptag kan utvärderas exakt, och realtidsspårning av EV-upptag är också möjligt. Vidare kan ev trafficking analys utföras med hjälp av konfokal mikroskopi genom att bedöma samlokalisering av EVs med organeller, ett första steg för att avgöra hur internaliserade EVs är involverade i den intracellulära funktionen. Detta protokoll beskriver metoden för att utföra en EV-upptagsanalys med hjälp av nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet17,26, konfokal mikroskopi och analys efter bilden.
Protocol
Representative Results
Discussion
En EV-upptagsanalys baserad på 3D-fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi ger en effektiv metodik och känslig analys. Denna fluorescerande EV-märkning underlättar visualiseringen av EVs och utför framgångsrikt en exakt EV-upptagsanalys. Tidigare metoder för märkning av elfordon och avlägsnande av restfärgen har rapporterats genom att nederbörd med hjälp av ultracentrifugation (UC) har avlägsnats. UC kan dock samfällera EVs, och det immobiliserade färgämnet kan leda till en falskt positiv <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NCI-bidragsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 och CA143055 till K. J. P. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Korea Health Technology R&D Project genom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansierat av Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (bidragsnummer: HI19C1122). Arbete av J. Kim och Y.-K. Cho stöddes av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansierat av den koreanska regeringen. Författarna tackar de nuvarande och tidigare medlemmarna i Brady Urological Institute, särskilt medlemmar av Pienta-Amend-laboratoriet, för den kritiska läsningen av manuskriptet.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
Riferimenti
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
