Dit protocol beschrijft hoe menselijke intestinale organoïden kunnen worden geïnfecteerd vanaf hun apicale of basolaterale kant om gastheer / pathogeeninteracties op eencellig niveau te karakteriseren met behulp van eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) -technologie.
Menselijke intestinale organoïden vormen het beste cellulaire model om pathogene infecties van het maagdarmkanaal te bestuderen. Deze organoïden kunnen worden afgeleid uit alle delen van het maagdarmkanaal (maag, jejunum, twaalfvingerige darm, ileum, colon, rectum) en bevatten, bij differentiatie, de meeste celtypen die van nature in elke afzonderlijke sectie voorkomen. Intestinale organoïden bevatten bijvoorbeeld voedingsstofabsorberende enterocyten, secretoire cellen (Goblet, Paneth en entero-endocriene), stamcellen, evenals alle afstammingsspecifieke differentiatie-intermediairen (bijv. Vroege of onrijpe celtypen). Het grootste voordeel bij het gebruik van van het maagdarmkanaal afgeleide organoïden om infectieziekten te bestuderen, is de mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren welk celtype het doelwit is van de enterische ziekteverwekker en om aan te pakken of de verschillende delen van het maagdarmkanaal en hun specifieke celtypen op dezelfde manier reageren op pathogene uitdagingen. In de afgelopen jaren zijn gastro-intestinale modellen, evenals organoïden uit andere weefsels, gebruikt om viraal tropisme en de mechanismen van pathogenese te bestuderen. Het gebruik van alle voordelen van het gebruik van organoïden bij het gebruik van hoogpathogene virussen vormt echter een technische uitdaging en vereist strikte bioveiligheidsoverwegingen. Bovendien, omdat organoïden vaak in drie dimensies worden gekweekt, is de basolaterale kant van de cellen naar de buitenkant van de organoïde gericht, terwijl hun apicale kant naar de binnenkant (lumen) van de organoïden is gericht. Deze organisatie vormt een uitdaging voor enterische pathogenen, omdat veel enterische infecties ontstaan vanuit de apicale / luminale kant van de cellen na inname. Het volgende manuscript zal een uitgebreid protocol bieden om menselijke intestinale organoïden voor te bereiden op infectie met enterische pathogenen door rekening te houden met de infectiezijde (apicale versus basolaterale) om eencellige RNA-sequencing uit te voeren om celtype-specifieke gastheer / pathogeen interacties te karakteriseren. Deze methode beschrijft de voorbereiding van de organoïden en de overwegingen die nodig zijn om dit werk uit te voeren onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) inperkingsomstandigheden.
Het bestuderen van het celtypespecifieke tropisme en de celtypespecifieke immuunrespons op menselijke enterische virussen is historisch uitdagend geweest vanwege het gebrek aan primaire menselijke cellulaire modellen. Deze beperking is nu gedeeltelijk uitgeroeid met de ontwikkeling van organoïden1. In het geval van het maagdarmkanaal zijn maag- en darmorganoïde modellen ontwikkeld voor mensen en verschillende andere soorten(bijv. Murine, runderen, katten, vleermuizen)2,3,4,5,6. Intestinale organoïden reproduceren de structurele architectuur van het menselijke darmepitheel en bevatten crypte- en villi-achtige structuren, functionele darmlijnen en zijn zelfs gebruikt om voorheen onbekende cellijnen te identificeren. Twee verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om intestinale organoïden te laten groeien. Ten eerste worden darmstammencellen die crypten bevatten geïsoleerd uit weefselresecties of biopsieën en gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijv. Wnt3A, R-spondin, Noggin en EGF) om uit te breiden, en vervolgens differentiëren de stamcellen naar de meeste darmcellijnen(bijv. Enterocyten, Paneth-cellen, Goblet-cellen, entero-endocriene cellen)7. Deze methode zorgt voor de isolatie van organoïden uit alle delen van het maagdarmkanaal(bijv., maag, twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en dikke darm). De tweede methode is gebaseerd op door de mens geïnduceerde pluripotente of embryonale stamcellen, die vervolgens in een stapsgewijs proces worden gedifferentieerd tot darmepitheelcellen8. Deze geïnduceerde op stamcellen gebaseerde organoïden worden vaak beschreven als meer embryonaal van aard in vergelijking met van de patiënt afgeleide organoïden. Hoewel al deze organoïde modellen van cruciaal belang zijn geweest voor het ontrafelen van ontwikkelingssignalen die nodig zijn om het darmkanaal te vormen, staat het gebruik ervan in onderzoek naar infectieziekten nog in de kinderschoenen.
Enterisch virus is een brede term die alle virussen omvat die via het maagdarmkanaal infecteren, zoals picornavirussen(bijv., EV-71), reovirussen (bijv. Rotavirus) en calicivirussen (bijv. Norovirus)9. Enterische virussen initiëren hun infectieuze levenscyclus door de inname van besmet voedsel en water, waardoor mensen in ontwikkelingslanden een hoog risico lopen als gevolg van de lozing van onbehandeld afval in het milieu en gebrek aan medische zorg na het begin van de infectie10. Afhankelijk van het type pathogeen kan de infectie leiden tot gastro-enteritis, braken en / of waterige diarree als gevolg van lekkage van de darmwand. Menselijke norovirussen zijn een veel voorkomende en zeer besmettelijke enterische ziekteverwekker, die wereldwijd leidt tot meer dan 600 miljoen infecties en 15 miljoen ziekenhuisopnames11. Organoïden zijn de sleutel geweest tot norovirusonderzoek omdat ze de infectie en replicatie van humaan norovirus ondersteunen, dat voorheen niet kon worden gekweekt in standaard celkweekmodellen12.
In de afgelopen twee decennia zijn coronavirussen naar voren gekomen als belangrijke menselijke pathogenen13. Deze familie omvat de hoogpathogene MERS, SARS-CoV-1 en SARS-CoV-2, die strikte veiligheidsniveaus vereisen bij het uitvoeren van onderzoek naar deze virussen. Interessant is dat, hoewel alle drie deze pathogenen meestal worden erkend voor hun geïnduceerde ademhalingssymptomen en nood, het nu duidelijk is dat deze virussen niet alleen de luchtwegen infecteren, maar ook andere organen. Een belangrijke pathologie geïnduceerd bij SARS-CoV-2 geïnfecteerde patiënten naast de ademnood is de aanwezigheid van gastro-intestinale symptomen14. Een fractie van de met SARS-CoV-2 geïnfecteerde patiënten vertoont dergelijke symptomen, variërend van zeer milde tot ernstige diarree. Bovendien kunnen SARS-CoV-2-genomen worden gedetecteerd in ontlastings- en maagdarmkanaalbiopten van geïnfecteerde patiënten15. Belangrijk is dat de aanwezigheid van gastro-intestinale symptomen niet beperkt is tot SARS-CoV-2, omdat ze ook werden waargenomen bij mers- en SARS-CoV-1-geïnfecteerde patiënten. Om te begrijpen hoe SARS-CoV-2 gastro-intestinale nood induceert en het tropisme van SARS-CoV-2 in het maagdarmkanaal nauwkeurig identificeert, zijn menselijke darmorganoïden een belangrijk hulpmiddel geweest en worden ze nu gebruikt om celtypespecifieke reacties op deze ziekteverwekker te ontrafelen16,17.
Transcriptionele profilering van een celpopulatie (bulk RNA-sequencing) is standaardpraktijk bij het evalueren van pathogene infecties van zowel onsterfelijke cellijnen als met organoïden. Hoewel dit ons in staat stelt om wereldwijde veranderingen te bepalen in reactie op pathogenen (bijv. Upregulatie van cytokines), stelt bulk RNAseq ons niet in staat om te bepalen waarom specifieke cellen in een populatie vatbaarder zijn voor infecties dan andere. Single-cell RNA sequencing (scRNAseq) is een krachtig hulpmiddel geworden om cellijn-specifieke transcriptionele programma’s te ontrafelen en kan worden gebruikt om te bepalen hoe deze programma’s virusinfectie ondersteunen of onderdrukken18,19. De eerste beschrijving van scRNAseq was in 2009 en werd gebruikt om de transcriptieprofielen van de verschillende cellen in een muisblastoomer20te evalueren. Deze technologieën zijn nu uitgebreid en kunnen via verschillende platforms worden geïmplementeerd. Vroege versies van deze technologie pasten fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) toe om individuele cellen te scheiden voor sequencing, wat vaak beperkt was tot 96- of 384-well platen, waardoor 300 individuele cellen per monster werden geanalyseerd21. Deze methoden zijn nu ontwikkeld door de single-cell sequencing platforms, die een microfluïdisch apparaat gebruiken om afzonderlijke cellen in te kapselen in individuele druppels met barcode die kralen bevatten. Met deze technologie kunnen tot 10.000 cellen per monsterconditie worden gevangen.
Door organoïdentechnologie te combineren met scRNAseq kunnen we bestuderen hoe enterische pathogenen het maagdarmkanaal op een celtypespecifieke manier beïnvloeden. Er moeten echter verschillende technische en bioveiligheidsoverwegingen worden genomen. Eerst en vooral stellen klassieke organoïdenkweekmethoden (3-dimensionale (3D) organoïden, ingebed in een extracellulaire matrix (ECM)) de basolaterale kant van de epitheelcellen bloot aan de buitenkant van de organoïde. Omdat enterische pathogenen hun infectie initiëren door inname van besmet voedsel / water, begint de infectie meestal vanaf de apicale kant van de cellen, die niet toegankelijk is in deze 3D-darmorganoïden. Daarom moeten organoïden worden voorbereid om de apicale kant toegankelijk te maken voor pathogene infectie, hetzij door 2D-zaaien, waardoor de apicale kant van de cellen direct wordt blootgesteld, of door micro-injectie22,23. Ten tweede, om scRNAseq van geïnfecteerde biologische monsters uit te voeren, is het belangrijk om rekening te houden met hun infectieuze aard. Hoewel methoden zijn voorgesteld om cellen te fixeren en pathogenen te inactiveren voorafgaand aan eencellige isolatie voor volgende RNAseq, leiden deze methoden vaak tot een afname van de sequencingkwaliteit18. Het onderstaande protocol beschrijft verschillende benaderingen om intestinale organoïden te infecteren met enterische virussen, rekening houdend met de infectiezijde (apicale versus basolaterale infectie) (figuur 1). Daarnaast zal het protocol een workflow bevatten om afzonderlijke cellen te dissociëren en te isoleren van organoïden die zijn geïnfecteerd met hoogpathogene virussen voor scRNAseq. Het protocol zal de belangrijkste stappen benadrukken die moeten worden geïmplementeerd bij het werken onder bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) inperkingsomstandigheden om het ontstaan van aerosolen en mogelijke besmetting te voorkomen.
Enterische pathogenen initiëren meestal hun levenscyclus door darmepitheelcellen te infecteren vanaf hun apicale kant naar het lumen van de darm. Hoewel organoïden algemeen worden erkend als een goed model om de cellulaire complexiteit en organisatie van het darmepitheel te reproduceren, maken hun organisatie als driedimensionale, gesloten structuren hun apicale membraan ontoegankelijk voor de ziekteverwekker. Dit protocol beschreef methoden voor het infecteren van intestinale organoïden vanaf hun apicale kant, hun basolaterale kant of beide met BLS-3 pathogenen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast om elke enterische ziekteverwekker onder BSL-2- of BLS-3-insluiting of een ander organoïdemodel te bestuderen door een paar kritieke stappen te volgen die hieronder worden gemarkeerd. De hierboven beschreven methode is voor de isolatie en bereiding van eencellige druppels in overeenstemming met de voorschriften in Duitsland. Als disclaimer beschrijft dit protocol niet de bioveiligheidsmaatregelen (standaard operationele procedures) die moeten worden genomen tijdens het werken onder BSL-3-omstandigheden. Het is ook belangrijk om erop aan te dringen dat de voorschriften in andere landen kunnen verschillen en dat de lokale autoriteiten moeten worden gecontacteerd om ervoor te zorgen dat alle lokale voorschriften worden nageleefd.
Een van de kritieke stappen bij het zaaien van organoïden in twee dimensies voor apicale infectie is het controleren dat cellen op dezelfde manier zullen differentiëren in vergelijking met wanneer ze worden gekweekt als klassieke driedimensionale organoïden. Afhankelijk van de enterische ziekteverwekker kan tropisme worden beperkt tot zeer zeldzame cellen of tot cellen die sterk gedifferentieerd moeten zijn. In dit geval zou het gebruik van een tweedimensionale organoïde die niet volledig differentieert, kunnen resulteren in de verkeerde conclusie dat deze enterische ziekteverwekker geen intestinale organoïden kan infecteren. Er wordt voorgesteld om, indien mogelijk, infecties uit te voeren met behulp van de drie configuraties van dit protocol: 2D-organoïde alleen voor apicale infectie (sectie 2), opengebroken 3D-organoïden voor apicale en basolaterale infectie (sectie 3) en volledige 3D-organoïden voor basolaterale infectie alleen (sectie 3). Deze aanpak zal helpen om de toegangsroute van de ziekteverwekker (apicale versus basolaterale) te onderscheiden en zal ook controleren dat een vergelijkbaar niveau van differentiatie is bereikt. Een alternatief voor 2D-apicale infectie is micro-injectie, waarbij een 3D-organoïde wordt gebruikt, maar de ziekteverwekker rechtstreeks in de apicale kant wordt afgeleverd (zie Bartfeld et al.27 voor details). Deze methode vereist een bekwame injector om ervoor te zorgen dat de ziekteverwekker op de juiste manier wordt geplaatst en dat de organoïden intact blijven. Micro-injectie wordt vaak gebruikt in BSL-2 containment en is mogelijk niet geschikt voor BSL-3 containment.
Een extra belangrijke overweging bij het uitvoeren van infectie-experimenten in 2D-gezaaide organoïden is de uiteindelijke celdichtheid. Zoals vermeld in stap 2.3, worden 100-150 organoïden gezaaid in een put van een 48-well plaat of een put van een 8-well glazen bodem kamer schuif. Afhankelijk van de organoïdelijn en van de persoon die de organoïden hanteert, kan de grootte van deze organoïden aanzienlijk verschillen. Dit kan resulteren in zeer verschillende celdichtheden in de 48-well plaat of 8-well glazen-bodem kamer schuif. Afhankelijk van het enterische virus geven sommige virussen de voorkeur aan meer schaarse cellen, terwijl anderen ook confluente cellen kunnen infecteren. De moleculaire oorsprong van dergelijke verschillen in infectiviteit voor verschillende celconfluenties is niet duidelijk; daarom moeten proefexperimenten worden uitgevoerd die gericht zijn op het vinden van de beste celdichtheid voor het enterische pathogeen van keuze voordat verdere downstream-karakterisering wordt uitgevoerd.
Vaak wordt FACS-sortering uitgevoerd voorafgaand aan het uitvoeren van de eencellige druppelemulsie. Deze stap wordt vaak gebruikt om doden van levende cellen en enkele cellen van doubletten te scheiden. Bij het werken met BSL-3-pathogenen vereist het dat de faciliteit is uitgerust met een geschikte FACS-sorteerder, wat niet vaak het geval is. Verder hebben niet alle cellen in een organoïde dezelfde grootte en is het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen een doublet of een grotere cel, waardoor het risico bestaat dat er negatief wordt geselecteerd op een specifiek celtype. Ook is er nog steeds discussie in het veld of de tijd die nodig is voor het sorteren tussen 5.000-10.000 voor elk monster zou kunnen resulteren in een significante wijziging van het transcriptprofiel van de individuele cellen. Hoewel celfixatiemethoden die compatibel zijn met single-cell sequencing (bijv. Methanol en RNAassist) zijn beschreven, werd waargenomen dat dit leidt tot een afname van de kwaliteit van sequencing18. Ten slotte wordt vermoed dat het sorteren van cellen met behulp van celdoodmarkers ook tot een bias kan leiden. Gezien de directionele proliferatie en differentiatie van de cellen door de crypt-villi-as, bevinden de meest gedifferentieerde cellen, die zullen worden afgestoten en vrijgegeven, zich aan de punt van de villi. Deze cellen zijn vaak positief voor verschillende markers van celdoodroutes(bijv. Apoptose, necrose en necroptose); echter, wanneer wordt gekeken naar rotavirusinfectie van de darm van muizen, is de punt van de villi het meest geïnfecteerde gebied28. Het filteren van cellen die er positief uitzien voor doodsmarkers zou dus resulteren in een negatieve selectie van de geïnfecteerde cellen die de fysiologische infectie kunnen vertegenwoordigen. Momenteel is er geen goede oplossing voor het sorteren en fixeren van organoïden voorafgaand aan single-cell sequencing. Het gebruik van levende, ongesorteerde cellen wordt aanbevolen omdat verdere studies nodig zijn om geschikte alternatieve protocollen te vinden.
Single-cell sequencing heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop cellulaire reacties kunnen worden geëvalueerd. Deze techniek maakt het mogelijk om cellijnspecifieke reacties te identificeren, zowel in basale omstandigheden als onder pathogene infecties. Deze methode heeft deuren geopend op veel gebieden die voorheen werden beperkt door bulkuitlezingen. Hoewel deze methode zeer krachtig is, heeft het zijn beperkingen. Een belangrijke beperking is de uitgebreide bioinformatische analyse die stroomafwaarts van de sequencing vereist is. Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van weefsels en het toewijzen van celtypen waar momenteel geen annotatie is. Het hebben van een bekwame bio-informaticus is vereist om alle eencellige studies te ondersteunen.
Dit protocol beschrijft hoe menselijke darmorganoïden te zaaien en te hanteren, ze te infecteren met enterische pathogenen en scRNAseq uit te voeren. Aanpassing van deze benadering aan andere organen is nu mogelijk, omdat voor de meeste organen organoïde modelsystemen zijn ontwikkeld. Long- en leverorganoïden zijn op dezelfde manier georganiseerd in vergelijking met intestinale organoïden en als zodanig kunnen met behulp van een analoge benadering naar deze organoïden worden getransponeerd. De kritische controle zal zijn om te valideren dat wanneer ze in twee dimensies worden gekweekt of opengebroken, deze organoïden een vergelijkbare differentiatie bereiken als hun 3D-organoïde tegenhangers. De specifieke kenmerken en genen die een gedifferentieerde status definiëren, zijn specifiek voor elk orgaanmodel. Andere organoïde modellen zoals nier- en vasculaire organoïden, grote dichte structuren, zullen aanvullende methoden nodig hebben om deze structuren serieel te dissociëren in enkele cellen.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer en Steeve Boulant werden ondersteund door onderzoekssubsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projectnummer 240245660, 278001972, 415089553, en 272983813 aan Steeve Boulant en 416072091 aan Megan Stanifer), de deelstaat Baden-Wuerttemberg en het Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B aan MS en 01KI20198A en (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) aan SB. Schematiek werd gemaakt in BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |