Este protocolo descreve como infectar organoides intestinais humanos de seu lado apical ou basolateral para caracterizar interações hospedeiro/patógeno no nível de célula única usando a tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (scRNAseq).
Organoides intestinais humanos constituem o melhor modelo celular para estudar infecções por patógenos do trato gastrointestinal. Esses organoides podem ser derivados de todas as seções do trato GI (gástrico, jejunum, duodeno, óleo, cólon, reto) e, após diferenciação, contêm a maioria dos tipos celulares que são naturalmente encontrados em cada seção individual. Por exemplo, organoides intestinais contêm enterócitos absorventes de nutrientes, células secretas (Cálice, Paneth e enteroendocrino), células-tronco, bem como todos os intermediários de diferenciação específicos da linhagem (por exemplo, tipos de células precoces ou imaturas). A maior vantagem no uso de organoides derivados do trato gastrointestinal para estudar doenças infecciosas é a possibilidade de identificar precisamente qual tipo de célula é alvo do patógeno entérico e abordar se as diferentes seções do trato gastrointestinal e seus tipos de células específicas respondem da mesma forma aos desafios do patógeno. Ao longo dos últimos anos, modelos gastrointestinais, bem como organoides de outros tecidos, têm sido empregados para estudar o tropismo viral e os mecanismos da patogênese. No entanto, utilizar todas as vantagens do uso de organoides ao empregar vírus altamente patogênicos representa um desafio técnico e requer rigorosas considerações de biossegurança. Além disso, como os organoides são frequentemente cultivados em três dimensões, o lado basolateral das células está voltado para o lado externo do organoide enquanto seu lado apical está voltado para o interior (lúmen) dos organoides. Esta organização representa um desafio para os patógenos entéricos, pois muitas infecções entéricas iniciam a partir do lado apical/luminal das células após a ingestão. O manuscrito a seguir fornecerá um protocolo abrangente para preparar organoides intestinais humanos para infecção com patógenos entéricos, considerando o lado da infecção (apical vs. basolateral) para realizar sequenciamento de RNA unicelular para caracterizar interações de hospedeiro/patógeno específicas do tipo celular. Este método detalha a preparação dos organoides, bem como as considerações necessárias para realizar este trabalho sob condições de contenção nível 3 (BSL-3).
Estudar o tropismo específico do tipo celular e a resposta imune específica do tipo celular aos vírus entéricos humanos tem sido historicamente desafiador devido à falta de modelos celulares humanos primários. Essa limitação foi agora parcialmente erradicada com o desenvolvimento de organoides1. No caso do trato gastrointestinal, foram desenvolvidos modelos organoides gástricos e intestinais para humanos e várias outras espécies (porexemplo,murina, bovina, felina, morcego)2,3,4,5,6. Organoides intestinais reproduzem a arquitetura estrutural do epitélio intestinal humano e contêm estruturas cripta e villi, linhagens intestinais funcionais e até têm sido usadas para identificar linhagens celulares até então desconhecidas. Duas abordagens diferentes podem ser usadas para cultivar organoides intestinais. Primeiro, as células de hastes intestinais contendo criptas são isoladas de ressecções teciduais ou biópsias e cultivadas sob condições específicas de cultura (por exemplo, Wnt3A, R-spondin, Noggin e EGF) para expandir e, em seguida, diferenciar as células-tronco para a maioria das linhagens celulares intestinais (porexemplo,, enterócitos, células panételes, células de Cálice, células enteroendrinas)7. Este método permite o isolamento de organoides de todas as seções do trato gastrointestinal(porexemplo, estômago, duodeno, jejunum, íleo e cólon). O segundo método baseia-se em células-tronco pluripotentes ou embrionárias induzidas pelo homem, que são então diferenciadas em um processo stepwise em células epiteliais intestinais8. Esses organoides induzidos à base de células-tronco são frequentemente descritos como sendo mais embrionários na natureza em comparação com organoides derivados do paciente. Embora todos esses modelos organoides tenham sido fundamentais para desvendar as pistas de desenvolvimento necessárias para formar o trato intestinal, seu uso em pesquisas de doenças infecciosas ainda está em sua infância.
O vírus entérico é um termo amplo que abrange todos os vírus, que infectam através do trato gastrointestinal, como picornavírus(porexemplo, EV-71), reovírus (por exemplo, rotavírus) e calicivírus (por exemplo, norovírus)9. Os vírus entéricos iniciam seu ciclo de vida infeccioso através da ingestão de alimentos e água contaminados, o que deixa as pessoas em países em desenvolvimento em alto risco devido à descarga de resíduos não tratados no meio ambiente e à falta de cuidados médicos após o início da infecção10. Dependendo do tipo de patógeno, a infecção pode levar à gastroenterite, vômitos e/ou diarreia aquática devido ao vazamento do revestimento intestinal. Os norovírus humanos são um patógeno entérico altamente prevalente e altamente infeccioso, que leva a mais de 600 milhões de infecções e 15 milhões de internações em todo o mundo11. Os organoides têm sido fundamentais para a pesquisa do norovírus, pois apoiam a infecção e a replicação do norovírus humano, que antes era incapaz de ser cultivado nos modelos de cultura celular padrão12.
Nas últimas duas décadas, os coronavírus emergiram como patógenos humanos-chave13. Esta família inclui os MERS altamente patogênicos, SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, que requerem restrições rigorosas de nível de segurança ao realizar pesquisas sobre esses vírus. Curiosamente, embora todos esses três patógenos sejam reconhecidos principalmente por seus sintomas respiratórios induzidos e angústia, agora é evidente que esses vírus não infectam apenas o trato respiratório, mas também outros órgãos. Uma patologia importante induzida em pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 além do problema respiratório é a presença de sintomas gastrointestinais14. Uma fração de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 apresenta tais sintomas, variando de diarreia muito leve a grave. Além disso, genomas SARS-CoV-2 podem ser detectados em fezes e biópsias do trato gastrointestinal de pacientes infectados15. É importante ressaltar que a presença de sintomas gastrointestinais não se limita ao SARS-CoV-2, pois também foram observados em pacientes infectados pelo MERS e SARS-CoV-1. Para entender como o SARS-CoV-2 induz a angústia gastrointestinal e identifica precisamente o tropismo do SARS-CoV-2 no trato gastrointestinal, os organoides intestinais humanos têm sido uma ferramenta-chave e agora são explorados para desvendar respostas específicas do tipo celular a este patógeno16,17.
O perfil transcricional de uma população celular (sequenciamento de RNA em massa) tem sido uma prática padrão ao avaliar infecções por patógenos tanto de linhas celulares imortalizadas quanto com organoides. Embora isso nos permita determinar mudanças globais em resposta a patógenos (por exemplo, a regulação das citocinas), o RNAseq em massa não nos permite determinar por que células específicas em uma população são mais propensas à infecção do que outras. O sequenciamento de RNA unicelular (scRNAseq) tornou-se uma ferramenta poderosa para desvendar programas transcricionais específicos da linhagem celular e pode ser usado para determinar como esses programas suportam ou reprimem a infecção por vírus18,19. A primeira descrição do scRNAseq foi em 2009 e foi usada para avaliar os perfis de transcrição das diferentes células encontradas em um blastomerede camundongos 20. Essas tecnologias foram expandidas e podem ser implementadas através de diversas plataformas diferentes. As versões iniciais desta tecnologia aplicaram o classificador celular ativado pela fluorescência (FACS) para separar células individuais para sequenciamento, que muitas vezes era limitado a placas de 96 ou 384 poços, dando assim 300 células individuais para analisar por amostra21. Esses métodos foram agora avançados pelas plataformas de sequenciamento unicelular, que usam um dispositivo microfluido para encapsular células únicas em gotículas individuais com código de barras contendo contas. Esta tecnologia permite que até 10.000 células sejam capturadas por condição amostral.
A combinação da tecnologia organoides com a scRNAseq nos permite estudar como os patógenos entéricos impactam o trato gastrointestinal de uma maneira específica do tipo celular. No entanto, várias considerações técnicas e de biossegurança precisam ser tomadas. Em primeiro lugar, os métodos de cultura organoides clássicos (3D) organoides, embutidos em uma matriz extracelular (ECM)) expõem o lado basolateral das células epiteliais para o exterior do organoide. À medida que os patógenos entéricos iniciam sua infecção através da ingestão de alimentos/água contaminados, a infecção mais frequentemente inicia a partir do lado apical das células, que não é acessível nesses organoides intestinais 3D. Portanto, os organoides precisam estar preparados para tornar o lado apical acessível para infecção por patógenos, seja através da semeadura 2D, expondo diretamente o lado apical das células, ou através da microinjeção22,23. Em segundo lugar, para realizar scRNAseq de amostras biológicas infectadas, é importante considerar sua natureza infecciosa. Embora métodos para corrigir células e inativar patógenos antes do isolamento unicelular para rnaseq subsequente tenham sido propostos, esses métodos muitas vezes levam a uma diminuição na qualidade de sequenciamento18. O protocolo abaixo descreverá várias abordagens para infectar organoides intestinais com vírus entéricos considerando o lado da infecção (infecção apical vs. basolateral)(Figura 1). Além disso, o protocolo incluirá um fluxo de trabalho para dissociar e isolar células únicas de organoides infectados com vírus altamente patogênicos para scRNAseq. O protocolo destacará as principais etapas que precisam ser implementadas ao trabalhar sob condições de contenção de nível 3 (BSL-3) de biossegurança para evitar a geração de aerossóis e a contaminação potencial.
Patógenos entéricos geralmente iniciam seu ciclo de vida infectando células epiteliais intestinais de seu lado apical voltado para o lúmen do intestino. Embora os organoides sejam bem reconhecidos como um bom modelo para reproduzir a complexidade celular e a organização do epitélio intestinal, sua organização como estruturas tridimensionais e fechadas tornam sua membrana apical inacessível ao patógeno. Este protocolo descreveu métodos para infectar organoides intestinais de seu lado apical, seu lado basolateral, ou ambos com patógenos BLS-3. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para estudar qualquer patógeno entérico sob contenção BSL-2 ou BLS-3 ou qualquer outro modelo organoide seguindo algumas etapas críticas que são destacadas abaixo. O método descrito acima é para o isolamento e preparação de gotículas unicelulares de acordo com as regulamentações na Alemanha. Como isenção de responsabilidade, este protocolo não descreve as medidas de tratamento de biossegurança (procedimentos operacionais padrão) que precisam ser tomadas enquanto trabalham sob condições BSL-3. Também é importante insistir que as regulamentações podem variar em outros países e que as autoridades locais devem ser contatadas para garantir que todas as regulamentações locais sejam respeitadas.
Um dos passos críticos na semeadura de organoides em duas dimensões para infecção apical é controlar que as células se diferenciarão da mesma forma em comparação com quando cultivadas como organoides tridimensionais clássicos. Dependendo do patógeno entérico, o tropismo pode ser restrito a células muito raras ou a células que precisam ser altamente diferenciadas. Neste caso, o uso de um organoide bidimensional que não se diferenciava totalmente poderia resultar na má conclusão de que este patógeno entérico não pode infectar organoides intestinais. Sugere-se, se possível, a realização de infecções utilizando as três configurações deste protocolo: organoide 2D apenas para infecção apical (seção 2), organoides 3D abertos para infecção apical e basolateral (seção 3), e organoides 3D completos apenas para infecção basolateral (seção 3). Esta abordagem ajudará a discernir a rota de entrada do patógeno (apical vs. basolateral) e também controlará que um nível semelhante de diferenciação foi alcançado. Uma alternativa para infecção apical 2D é a microinjeção, que usará um organoide 3D, mas fornecerá o patógeno diretamente para o lado apical (ver Bartfeld et al.27 para obter detalhes). Este método requer um injetor qualificado para garantir que o patógeno esteja devidamente colocado, e os organoides permaneçam intactos. A microinjeção é comumente usada na contenção BSL-2 e pode não ser adequada para contenção BSL-3.
Uma consideração importante adicional na realização de experimentos de infecção em organoides semeados em 2D é a densidade celular final. Como mencionado na etapa 2.3, 100-150 organoides serão semeados em um poço de uma placa de 48 poços ou um poço de um deslizamento de câmara de vidro de 8 poços. Dependendo da linha organoide e da pessoa que manuseia os organoides, o tamanho desses organoides pode ser significativamente diferente. Isso pode resultar em densidades celulares muito diferentes na placa de 48 poços ou em deslizamento de câmara de vidro de 8 poços. Dependendo do vírus entérico, alguns vírus preferem células mais esparsas, enquanto outros também serão capazes de infectar células confluentes. A origem molecular de tais diferenças na infectividade para diferentes confluências celulares não é clara; portanto, experimentos piloto com o objetivo de encontrar a melhor densidade celular para o patógeno entérico de escolha devem ser realizados antes de realizar uma caracterização mais a jusante.
Muitas vezes a classificação FACS é realizada antes de realizar a emulsão de gotícula de célula única. Esta etapa é frequentemente usada para separar mortos de células vivas e células únicas de doublets. Ao trabalhar com patógenos BSL-3, requer que a instalação esteja equipada com um classificador FACS apropriado, o que não é frequentemente o caso. Além disso, nem todas as células em um organoide têm o mesmo tamanho, e muitas vezes é difícil discriminar entre um doublet ou uma célula maior, causando assim o risco de seleção negativa contra um tipo de célula específica. Além disso, ainda há discussão no campo se o tempo necessário para a triagem entre 5.000-10.000 para cada amostra poderia resultar em uma modificação significativa do perfil de transcrição das células individuais. Embora tenham sido descritos métodos de fixação celular compatíveis com sequenciamento unicelular (por exemplo, metanol e RNAassist), observou-se que isso leva a uma diminuição na qualidade do sequenciamento18. Finalmente, suspeita-se que a triagem de células usando marcadores de morte celular também pode levar a um viés. Dada a proliferação direcional e diferenciação das células através do eixo cripta-villi, as células mais diferenciadas, que serão derramadas e liberadas, estão localizadas na ponta do villi. Essas células são muitas vezes positivas para diferentes marcadores de vias de morte celular (porexemplo, apoptose, necrose e necroptose); no entanto, ao olhar para a infecção rotavírus do intestino do camundongo, a ponta do villi é a área mais infectada28. Assim, filtrar células que possam parecer positivas para marcadores de morte resultaria em uma seleção negativa das células infectadas que podem representar a infecção fisiológica. Atualmente, não há uma boa solução para classificar e fixar organoides antes do sequenciamento unicelular. O uso de células vivas e não sortidas é recomendado, pois são necessários estudos adicionais para encontrar protocolos alternativos adequados.
O sequenciamento unicelular revolucionou a forma como as respostas celulares podem ser avaliadas. Esta técnica permite a identificação de respostas específicas da linhagem celular, tanto em condições basais quanto sob infecções por patógenos. Este método abriu portas em muitos campos que antes eram limitados por leituras em massa. Embora este método seja muito poderoso, ele tem suas limitações. Uma limitação fundamental é a extensa análise bioinformática que é necessária a jusante do sequenciamento. Isso é especialmente fundamental ao analisar tecidos e atribuir tipos de células onde atualmente não há anotação. Ter um bioinformático qualificado é necessário para apoiar todos os estudos unicelulares.
Este protocolo descreve como semear e lidar com organoides intestinais humanos, infectá-los com patógenos entericos e realizar scRNAseq. Adaptar essa abordagem a outros órgãos agora é possível, já que sistemas de modelo organoide foram desenvolvidos para a maioria dos órgãos. Os organoides pulmonares e hepáticos são igualmente organizados em comparação com organoides intestinais, e como tal, o uso de uma abordagem análoga poderia ser transposto para esses organoides. O controle crítico será validar que, quando cultivados em duas dimensões ou abertos, esses organoides alcançam diferenciação semelhante à de suas contrapartes organoides 3D. As características e genes específicos que definem um status diferenciado são específicos para cada modelo de órgão. Outros modelos organoides, como organoides renais e vasculares, grandes estruturas densas, precisarão de métodos adicionais para dissociar essas estruturas em células únicas.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer e Steeve Boulant foram apoiadas por bolsas de pesquisa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projeto número 240245660, 278001972, 415089553 e 272983813 para Steeve Boulant e 416072091 para Megan Stanifer), o estado de Baden-Wuerttemberg e o Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B para MS e 01KI20198A e NUM (-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) para SB. Os esquemas foram criados em BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |