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Ingegneria

Medindo a evolução temporal de materiais em nanoescala com espalhamento de nêutrons de fluxo interrompido e de pequeno ângulo

Published: August 06, 2021
doi:
10.3791/62873
, , , ,
1NIST Center for Neutron Research,National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemistry and Biochemistry,University of Windsor, 3Department of Physics,University of Windsor

Summary

Este protocolo apresenta o uso de um ambiente de amostra de fluxo interrompido para misturar rapidamente múltiplas soluções líquidas in situ durante uma medição de espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo e para estudar processos cinéticos em escalas de comprimento nanométrico e segundas escalas de tempo.

Abstract

Este artigo apresenta o uso de um ambiente de amostra de espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) de fluxo interrompido para misturar rapidamente amostras líquidas e estudar processos cinéticos em nanoescala em escalas de tempo de segundos a minutos. O ambiente de amostra de fluxo interrompido usa bombas de seringa disponíveis comercialmente para misturar os volumes desejados de amostras líquidas que são então injetadas através de um misturador dinâmico em uma célula de vidro de quartzo em aproximadamente 1 s. A aquisição de dados SANS resolvida no tempo é sincronizada com a mistura de amostras para acompanhar a evolução da nanoestrutura em solução após a mistura.

Para fazer o uso mais eficiente do tempo de feixe de nêutrons, usamos uma série de válvulas seletoras de fluxo para carregar, enxaguar e secar automaticamente a célula entre as medições, permitindo a coleta repetida de dados ao longo de várias injeções de amostra. As injeções de amostra são repetidas até que estatísticas suficientes de espalhamento de nêutrons sejam coletadas. A configuração de mistura pode ser programada para variar sistematicamente as condições para medir a cinética em diferentes razões de mistura, concentrações de amostra, concentrações de aditivos e temperaturas. O volume mínimo de amostra necessário por injeção é de aproximadamente 150 μL, dependendo do comprimento do caminho da célula de quartzo.

Resultados representativos usando este ambiente de amostra de fluxo interrompido são apresentados para uma cinética de troca rápida de lipídios na presença de um aditivo, a ciclodextrina. As vesículas trocam os lipídios do folheto externo (exterior) na ordem de segundos e trocam totalmente os lipídios internos e externos em poucas horas. A medição da cinética de troca lipídica requer mistura in situ para capturar os processos mais rápidos (segundos) e mais lentos (minutos) e extrair as constantes de taxa cinética. O mesmo ambiente de amostra também pode ser usado para sondar a troca molecular em outros tipos de amostras líquidas, como nanopartículas lipídicas, proteínas, surfactantes, polímeros, emulsões ou nanopartículas inorgânicas. Medir as transformações estruturais em nanoescala e a cinética de sistemas de troca ou reação fornecerá novos insights sobre os processos que evoluem na nanoescala.

Introduction

O espalhamento de nêutrons a baixo ângulo (SANS) fornece uma maneira única de medir os tamanhos, formas, interações e organização de vários materiais em escalas de comprimento de ≈1 nm a ≈100 nm 1,2,3. Instrumentos recentes, incluindo instrumentos VSANS (very small-angle neutron scattering) com espelhos de focalização, ultrapassam os limites para medir escalas de comprimento ainda maiores de até ≈1000 nm 4,5. Em geral, o contraste de espalhamento único inerente aos métodos de espalhamento de nêutrons oferece várias vantagens na mensuração do tempo de evolução de estruturas nanométricas, tais como a agregação de componentes em formulações farmacêuticas6, reações de reticulação e gelificação em sistemas poliméricos7,8, na mesocristalização de proteínas de membrana9,10, degradação e desdobramento de proteínas11,12 e crescimento de materiais à base de sílica13,14,15. O contraste de dispersão exclusivo torna o SANS (TR-SANS) resolvido no tempo um complemento útil para outras medições baseadas em fluxo parado.

Métodos de mistura de fluxo interrompido são frequentemente implementados em espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)16,17,18,19,20,21, espectroscopia de fluorescência 22,23,24,25,26 e espalhamento de luz27,28,29,30, 31,32 experimentos para estudar processos cinéticos em escalas de tempo de milissegundos. Uma diferença importante entre SANS e SAXS é que o espalhamento de nêutrons é uma técnica de caracterização não destrutiva e, como tal, o SANS pode ser usado para medir a mesma amostra por horas ou até dias sem danos de radiação ionizante na amostra, o que pode acontecer durante experimentos de espalhamento de raios X de alto fluxo33. Como medidas repetidas de SANS não alteram a estrutura química da molécula ou amostra da sonda, a evolução temporal pode ser estudada sem efeitos do fotoclareamento, por exemplo, o que pode complicar medidas cinéticas que dependem de fluorescência23,24. Além disso, o SANS pode ser usado para medir amostras altamente concentradas e opticamente opacas que muitas vezes são difíceis de caracterizar com técnicas baseadas em luz, como espalhamento dinâmico de luz.

Além de fornecer informações estruturais sobre a nanoescala, o SANS pode ser usado para sondar a composição local dessas estruturas através da variação no contraste de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons. A densidade de comprimento de espalhamento (SLD) de diferentes elementos varia aleatoriamente ao longo da tabela periódica e varia com diferentes isótopos do mesmo elemento. Um exemplo comumente explorado é o hidrogênio (1H ou H) e o deutério (2H ou D), que têm comprimentos de espalhamento de nêutrons muito diferentes. Portanto, materiais ricos em hidrogênio, como surfactantes, lipídios, proteínas, RNA, DNA e outros polímeros, podem ser distinguidos dos solventes deuterados usando SANS sem alterar significativamente as propriedades físicas do sistema. No entanto, é importante notar que a troca H/D pode afetar a densidade, a ligação de hidrogênio e as temperaturas de transição de fase na amostra. No entanto, a sensibilidade única do SANS a materiais ricos em hidrogênio é especialmente útil em pesquisas de matéria mole, onde as amostras de interesse têm menor espalhamento, contraste e sinal em técnicas baseadas em raios-X, como o SAXS. A substituição isotópica também torna o SANS uma ferramenta poderosa para estudar a cinética de troca molecular em materiais ricos em hidrogênio simplesmente misturando moléculas marcadas com H e D. A substituição isotópica é particularmente útil em sistemas onde corantes fluorescentes volumosos são maiores que o surfactante ou moléculas lipídicas de interesse e podem influenciar a cinética de troca34,35.

As medições SANS resolvidas no tempo são vantajosas porque a intensidade medida é função do tempo, da escala de comprimento e do contraste SLD. Como tal, os experimentos TR-SANS podem ser projetados para investigar as mudanças dependentes do tempo nas distribuições espaciais e nas composições das amostras. Essas vantagens únicas do SANS levaram a importantes insights sobre processos cinéticos em muitos sistemas de materiais moles, como surfactantes 36,37,38, emulsões 39,40,41, lipídios 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ,50, e polímeros 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. A maioria dos estudos TR-SANS tem se concentrado em escalas de tempo de minutos a horas. No entanto, muitos processos cinéticos de interesse ocorrem na segunda escala de tempo e são essenciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes. A captura desses primeiros pontos de tempo requer que as soluções sejam rapidamente misturadas e medidas in situ, nas quais a mistura é sincronizada com a coleta de dados durante o espalhamento de luz de fluxo interrompido 27,28,29,30,31,32, fluorescência 22,23,24,25,26 e raios X 16,17,18,19,20,21 experimentos. Este trabalho descreve o uso de um ambiente de amostra projetado para misturar rapidamente várias amostras líquidas e injetar a mistura em uma célula de vidro de quartzo para medições de TR-SANS. O dispositivo de mistura é uma adaptação do dispositivo reoSANS capilar63 recentemente desenvolvido e usa várias bombas de seringa e válvulas para controlar a mistura de amostras e automatizar a limpeza das células. Ao conectar bombas de seringa a uma série de válvulas seletoras de fluxo, vários fluxos de entrada podem ser repetidamente misturados, medidos, enxaguados e secos para facilitar as medições TR-SANS na escala de tempo de segundos.

O procedimento atual pressupõe que as amostras de interesse tenham sido identificadas e preparadas. Nós nos concentramos na configuração de mistura in situ e nos métodos para coletar dados TR-SANS. Os dados de espalhamento de nêutrons foram coletados no instrumento VSANS no NIST Center for Neutron Research (NCNR); no entanto, o procedimento deve ser aplicável a outros instrumentos SANS. Os leitores interessados em implementar protocolos semelhantes em outros instrumentos SANS devem consultar os cientistas locais do instrumento para determinar a configuração ideal do instrumento para maximizar o fluxo de nêutrons na escala de comprimento e tempo desejadas mais relevantes para os processos cinéticos de interesse. Os dados aqui apresentados foram coletados usando a configuração de feixe branco de alto fluxo em VSANS para maximizar a contagem de nêutrons na perda de resolução espacial5. Os carruagens dos detectores foram posicionados de modo a cobrir uma faixa de vetores de espalhamento (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 Å-1, correspondendo a escalas de comprimento de ≈130 nm a ≈13 nm. O vetor de espalhamento é definido como q = 4π/λ pecado (θ/2) em que λ é o comprimento de onda de nêutrons, e θ é o ângulo de espalhamento.

O dispositivo de mistura de fluxo parado usado para as medições TR-SANS consiste em várias bombas, seringas de enxágue, seringas de amostra, seletores de fluxo, bem como misturador adinâmico, célula de amostra e recipiente de amostra mista, como mostrado na Figura 1. Todos os caminhos de fluido selados estão localizados dentro de um gabinete com ar condicionado, que inclui seringas, válvulas, tubos de conexão, misturador dinâmico e células de amostra. Um ar condicionado termoelétrico programável é usado para controlar a temperatura do gabinete na faixa de 10 °C a 50 °C dentro de ±1 °C. Observe que parte do isolamento do gabinete foi removido para mostrar as partes de trabalho do dispositivo. O gabinete do dispositivo de mistura principal é posicionado em um estágio de translação na linha de luz NG3 VSANS no NCNR. A posição do compartimento é ajustada usando o estágio de translação para posicionar a célula de amostra no caminho do feixe de nêutrons (linha tracejada amarela).

Figure 1
Figura 1: Um exemplo de configuração para combinar medições de mistura de fluxo interrompido e espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo na linha de luz VSANS no NIST Center for Neutron Research. A configuração contém quatro bombas de seringa, duas seringas para enxágue com solvente e duas seringas para injeção de amostra, quatro válvulas seletoras de bomba, duas válvulas seletoras de misturador, um misturador dinâmico, uma célula de quartzo de fluxo e um recipiente de amostra mista. Os nêutrons incidentes se espalham pela amostra mista localizada dentro da célula da amostra. Um gabinete isolado com janelas de quartzo e uma unidade termoelétrica de ar condicionado é usado para controlar a amostra e todos os equipamentos a uma temperatura constante. A linha tracejada amarela mostra o caminho do feixe de nêutrons. Barra de escala = 10 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O dispositivo representado na Figura 1 é configurado com duas seringas de amostra, duas seringas de enxágue e uma célula de amostra. Os fluxogramas correspondentes para as diferentes etapas do protocolo estão ilustrados na Figura 2. Os volumes desejados das duas amostras diferentes são injetados no misturador e na célula da amostra (Figura 2A). Uma vez que a célula de amostra é preenchida, a válvula de comutador de entrada (ISV) e a válvula de comutador de saída (OSV) são fechadas para isolar a célula de amostra do misturador dinâmico e evitar a retrodifusão da amostra na célula durante a coleta de dados do TR-SANS (Figura 2B). Antes do misturador dinâmico, a tubulação de conexão varia em comprimento de 10 cm a 1 m e não afeta o tempo de atraso de mistura. No entanto, as conexões de tubulação entre o misturador dinâmico e a célula de amostra afetarão o tempo de atraso de mistura e o volume de injeção de amostra necessário. Tubos pré-cortados de aço inoxidável com diâmetro interno de 0,04 polegadas (1 mm) e 100 mm de comprimento são usados para conectar o misturador dinâmico, as válvulas seletoras do misturador (MSV1 e MSV2) e o ISV e OSV. Tubos fluorados com 1 mm de diâmetro interno e 115 mm de comprimento são usados para conectar o ISV e o OSV (ou a saída dinâmica do misturador) à célula da amostra. O volume total de micção que influencia o tempo de atraso de mistura inclui o volume de micção do misturador (0,15 mL), a tubulação entre a saída do misturador e a entrada da célula de amostra (0,09 mL) e o volume da célula de amostra (0,16 mL). Neste exemplo, o volume total da micção é de 0,4 mL. Os volumes de vazios internos das válvulas são insignificantes em comparação com os volumes de vazio de tubulação, misturador e célula de amostra. Por exemplo, as válvulas seletoras de baixa pressão empregadas (diâmetro do furo de 0,75 mm) contêm volumes de vazio aproximados de 4 μL, enquanto as válvulas seletoras de alta pressão e válvulas de comutação (diâmetro do furo de 0,25 mm) contêm volumes de vazio aproximados de 0,5 μL.

Após a conclusão da medição do TR-SANS, a amostra é empurrada para fora da célula com solvente, e o solvente de enxágue é bombeado repetidamente através da célula para remover a amostra residual e limpar a célula da amostra (Figura 2C). Observe que as seringas de enxágue são conectadas a reservatórios de solvente maiores (por exemplo, água e etanol) por meio de valores de seletor de bomba para garantir que volumes adequados de solvente estejam disponíveis para limpar a célula de amostra entre as execuções de medição. Fontes de solventes, fontes de amostras e recipientes de amostras mistas que contêm líquidos inflamáveis são posicionados em um compartimento separado sem equipamento elétrico para eliminar todas as possíveis fontes de ignição. Além disso, tampas de garrafas com bloqueio de vapor são usadas para minimizar vapores inflamáveis e evaporação de solventes. Finalmente, a célula da amostra é seca com uma corrente de gás nitrogênio para remover o solvente de enxágue residual (Figura 2D). A pressão de entrada do gás nitrogênio para a válvula seletora do misturador é regulada para aproximadamente 2 bar (0,2 MPa, pressão manométrica) usando um regulador de pressão manual localizado no cilindro de gás nitrogênio. Uma vez que a célula de amostra esteja suficientemente limpa e seca, uma nova amostra misturada é injetada na célula de amostra para o próximo ciclo de medição (repetindo a mistura e a injeção ilustradas no diagrama de fluxo na Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Exemplo de diagrama de fluxo usando uma célula de amostra, duas amostras misturando e dois solventes de enxágue para limpeza . (A) Mistura da amostra A (azul) e da amostra B (vermelho) e, em seguida, fluir a amostra mista (roxa) para a célula da amostra. (B) Durante a coleta de dados, o dispositivo de fluxo interrompido indica onde as válvulas de comutação ISV e OSV são fechadas para isolar a célula da amostra e impedir a retrodifusão da amostra durante a coleta de dados. (C) As etapas de limpeza em que a célula da amostra é lavada com solvente de enxágue de SS1 (verde) após a coleta de dados. (D) Etapa de secagem em que a célula da amostra é seca com gás nitrogênio (laranja). Abreviações: PSV = válvula seletora da bomba; MSV = válvula seletora misturadora; OSV = válvula de interruptor de saída; ISV = válvula de comutador de entrada; SS1 = fonte de solvente 1; SSA = fonte de amostra A; N2 = fonte de gás nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra diagramas de fluxo para uma versão ligeiramente diferente, na qual a configuração de mistura é configurada com duas células de amostra separadas conectadas às mesmas válvulas de comutação (Figura 3A). Enquanto os dados do TR-SANS são coletados na célula de amostra 1, a célula de amostra 2 é lavada (Figura 3B) e seca (Figura 3C). Quando a coleta de dados é concluída para a Célula de Amostra 1, a Válvula do Interruptor de Entrada direciona uma amostra recém-misturada para a Célula de Amostra 2 para a coleta de dados (Figura 3D). Enquanto os dados do TR-SANS são coletados na célula de amostra 2, a célula de amostra 1 é lavada e seca (Figura 3E). Este processo alternado e paralelo entre duas células de amostra minimiza o tempo entre as injeções subsequentes da amostra e maximiza o uso do tempo do feixe de nêutrons.

Figure 3
Figura 3: Exemplo de diagrama de fluxo usando duas células de amostra, duas amostras misturando e dois solventes de enxágue para limpeza. (A) Misturar a amostra A (azul) e a amostra B (vermelho) e, em seguida, fluir a amostra mista (roxa) para a célula 1 da amostra. (B) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 1, enquanto a célula de amostra 2 é lavada com solvente de SS1 (verde). (C) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 1, enquanto a célula de amostra 2 é seca com gás nitrogênio (laranja). (D) Uma vez concluída a coleta de dados da célula 1 da amostra, uma nova amostra (roxa) é imediatamente misturada e fluída para a célula 2 da amostra. (E) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 2, enquanto a célula de amostra 1 é lavada com solvente de SS1 (verde). Enquanto uma célula de amostra está sendo medida, a outra célula de amostra está sendo limpa e seca. O processo de medição de fluxo interrompido alterna entre duas células de amostra para minimizar o tempo entre as injeções subsequentes de mistura de amostras. Abreviações: PSV = válvula seletora da bomba; MSV = válvula seletora misturadora; OSV = válvula de interruptor de saída; ISV = válvula de comutador de entrada; SS1 = fonte de solvente 1; SSA = fonte de amostra A; N2 = fonte de gás nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um protocolo passo a passo é descrito abaixo para conectar as bombas e linhas de tubulação, preparar o sistema, enxaguar e secar a célula da amostra e injetar a amostra mista. Embora a configuração de célula única seja demonstrada pela simplicidade (Figura 2), a configuração modular flexível, o protocolo e os scripts podem ser facilmente modificados para implementar mais bombas de seringa, válvulas, misturadores ou configurações de célula de amostra, como a configuração de célula de duas amostras mostrada na Figura 3. Dados representativos da taxa bruta de contagem de nêutrons coletados ao longo dos ciclos de injeção de mistura e limpeza são mostrados na Figura 4, enquanto a cinética de troca lipídica medida em 3 temperaturas diferentes e a intensidade dispersa normalizada extraída correspondente à fração de lipídios trocados são mostrados na Figura 5 e na Figura 6, respectivamente.

Protocol

1. Configure e inicie o sistema de fluxo interrompido. Ligue todas as fontes de alimentação da bomba e misturadores dinâmicos usando o interruptor de alimentação. Inicie todas as bombas e válvulas na interface gráfica do usuário (GUI) de controle do sistema de fluxo interrompido inserindo o caminho de configuração do dispositivo e usando os comandos bus=qmixbus. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), …

Representative Results

Os dados representativos de nêutrons aqui apresentados medem a cinética de troca lipídica na presença de metil-β-ciclodextrina (mβCD), um aditivo que catalisa a troca lipídica entre vesículas com a taxa de câmbio (ke)66,67. Estudos prévios de fluorescência mostraram que k e depende da concentração de mβCD,e a meia-vida do processo de troca é da ordem deminutos 68. Os presentes experimentos utilizam TR-S…

Discussion

O procedimento atual descreve o dispositivo de mistura e as etapas para executar medições TR-SANS de fluxo interrompido. O dispositivo e o protocolo são otimizados para amostras líquidas de baixa viscosidade onde as escalas de tempo de interesse são de ≈1 s a 5 min. Para escalas de tempo superiores a 5 min, misturar manualmente as amostras e carregá-las em células de espalhamento padrão pode ser mais fácil e desejável, especialmente para amostras, géis ou pastas de alta viscosidade. O acesso a escalas de tem…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O acesso ao NG3 VSANS foi fornecido pelo Center for High-Resolution Neutron Scattering, uma parceria entre o National Institute of Standards and Technology e a National Science Foundation sob o Acordo Nº DMR-2010792. M.H.L.N reconhece o financiamento fornecido pela Mitacs Globalink (Canadá). A identificação de quaisquer produtos comerciais ou nomes comerciais é para promover a compreensão e não implica endosso ou recomendação pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia.

Materials

Dynamic mixer Analytical Scientific Instruments 462-0150A Magnetically coupled rotor, binary dynamic mixer assembly (ternary type available), 0.15 mL dead volume (larger dead volume available)
Fluoropolymer tubing IDEX Health & Science 1507L PFA Tubing Natural 1/16 inch OD x 0.040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flangeless fittings IDEX Health & Science XP-245 PFA flangeless fitting with ferrules, 1/4-28 threading, 1/16 inch OD tubing
Glass syringes Hamilton Company 81660 Hamilton 1000 series syringes, 10 mL (81660), model 1010 C syr, 1/4"-28 thread termination, other volumes available
High-pressure flow selector valves Vici Valco C85X-1570EUTB Vici 10 position selector valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure switch valves Vici Valco C82X-1574EUHB Vici 4 port switch valves, 15000 psi max, 0.25 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 10-32 coned threaded ports, USB universal actuator
High-pressure syringes Cetoni A2019000358 3 mL stainless steel syringe, 510 bar max, 21 mL/min flow rate max
Low-pressure flow selector valves Vici Valco C25-3180EUHB Vici 10 position selector valves, max 250 psi liquid, 0.75 mm bore, 1/16 inch OD tubing, 1/4-28 threaded ports, USB universal actuator
neMESYS high-pressure syringe pumps Cetoni A3921000103 Max force 2600 N
neMESYS mid-pressure syringe pumps Cetoni A3921000131 Max force 1000 N
Power supply Cetoni A3921000127 Base 600, supplies power for up to 4 high pressure pumps
Quartz flow-through sample cell Starna Scientific 3-2.30-Q-1/TC Quartz micro flow cells, 2 mm path length (1 mm available), 2 mm by 2 mm by 30 mm internal dimension
Quartz windows Technical Glass Products NA GE 124 Clear fused quartz ground and polished plates, 11.75 inch by 23.75 inch by 0.375 inch thick
Stainless steel 10-32 coned compression fittings IDEX Health & Science U-321X, U-320X 316 stainless steel ferrule (U-321X) and nut (U-320X) -Valco type, 10-32 coned, for 1/16 inch OD stainless steel tubing
Stainless steel tubing IDEX Health & Science U-102 Stainless Steel Tubing 1/16 inch OD x 0.020 inch ID, 10 cm, various precut lengths available
Syringe pump control software Cetoni T6000000004 QmixElements software for nemesys pumps, QmixSDK software development kit
Thermoelectric air conditioner EIC Solutions AAC-140C-4XT-HC Thermoelectric air conditioner mounted on insulated enclosure to control the pump, valve, mixer, and sample temperature
T-slot railing McMaster-Carr 47065T103 Aluminum t-slotted railing (1.5 inch by 1.5 inch) cut to various lengths
Vapor locking bottle caps  Cole-Parmer EW-12018-02 Four 304 SS port inserts, 1/4"-28 threads, GL45 bottle cap size, PTFE body, SS threads, PP collar
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Kelley, E. G., Nguyen, M. H. L., Marquardt, D., Maranville, B. B., Murphy, R. P. Measuring the Time-Evolution of Nanoscale Materials with Stopped-Flow and Small-Angle Neutron Scattering. J. Vis. Exp. (174), e62873, doi:10.3791/62873 (2021).
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