Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Global identifikasjon av samoversettelsesinteraksjonsnettverk ved selektiv ribosomeprofilering

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Samoversettelsesinteraksjoner spiller en avgjørende rolle i nascent-kjedemodifikasjoner, målretting, folding og monteringsveier. Her beskriver vi Selektiv Ribosome Profilering, en metode for in vivo, direkte analyse av disse interaksjonene i modellen eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I de senere år har det blitt tydelig at ribosomer ikke bare dekoder mRNA-en vår, men også styrer fremveksten av polypeptidkjeden inn i det overfylte cellulære miljøet. Ribosomer gir plattformen for romlig og kinetisk kontrollert binding av membranmålrettingsfaktorer, modifiserende enzymer og brettbare anstander. Selv monteringen i høyordente oligomeriske komplekser, samt proteinproteinnettverksdannelsestrinn, ble nylig oppdaget å være koordinert med syntese.

Her beskriver vi Selective Ribosome Profiling, en metode utviklet for å fange opp co-translational interaksjoner in vivo. Vi vil detaljere de ulike affinitetsrensingstrinnene som kreves for å fange ribosom-nascent-kjedekomplekser sammen med kooversettelsesinteraksjoner, samt mRNA-ekstraksjon, størrelsesekskludering, omvendt transkripsjon, dypsekvensering og stordataanalysetrinn, som kreves for å dechiffrere kooversettelsesinteraksjoner i nesten-codon-oppløsning.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) er den eneste metoden, til dags dato, som fanger opp og karakteriserer co-translational interaksjoner, in vivo, på en direkte måte 1,2,3,4,5,6. SeRP muliggjør global profilering av interaksjoner av enhver faktor med oversettelse av ribosomer i nær codon-oppløsning 2,7.

Metoden er avhengig av flashfrysing av voksende celler og bevaring av aktiv oversettelse. Cellelysater behandles deretter med RNase I for å fordøye all mRNA i cellen bortsett fra ribosombeskyttede mRNA-fragmenter kalt "ribosome fotavtrykk". Prøven deles deretter i to deler. en del brukes direkte til isolering av alle de cellulære ribosomale fotavtrykkene, som representerer alle pågående oversettelser i cellen. Den andre delen brukes til affinitetsrensing av den spesifikke undergruppen av ribosomer forbundet med en interessefaktor, for eksempel: modifisere enzymer, translokasjonsfaktorer, sammenleggbare anstander og komplekse monteringsinteraksjoner. De affinitetsrensede ribosomale fotavtrykkene betegnes samlet som interaktivitet. Deretter ekstraheres ribosombeskyttede mRNAer og brukes til cDNA-bibliotekgenerering, etterfulgt av dyp sekvensering.

Komparativ analyse av de totale translatom- og interactome-prøvene gjør det mulig å identifisere alle orfer som er knyttet til interessefaktoren, samt karakterisering av hver orf interaksjonsprofil. Denne profilen rapporterer de nøyaktige engasjements- og avslutningssekvensene som man kan utlede de dekodede codonene og de respektive rester av den fremvoksende polypeptidkjeden, samt på ribosomets hastighetsvariasjoner under samspillet 7,8. Figur 1 viser protokollen som et skjema.

Figure 1
Figur 1: En oversikt over SeRP-protokollen. Denne protokollen kan utføres i sin helhet innen 7-10 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generere stammer for selektiv ribosomeprofilering

MERK: Selective Ribosome Profiling (SeRP) er en metode som er avhengig av affinitetsrensing av interessefaktorer, for å vurdere deres modus for interaksjon med ribosomer-nascent kjedekomplekser. Homolog rekombinasjon9, samt CRISPR /Cas910-baserte metoder brukes til å smelte sammen ulike faktorer av interesse med koder for affinitetsrensing. Slike koder er GFP, for GFP-felle affinitetsrensinger, TAP-tag for IgG-Sepharose perler renselser samt AVI-Tag renset av avidin eller streptavidin, for å liste opp noen vellykkede eksempler fra de siste årene.

  1. Utfør vekst eller funksjonelle analyser for å validere at merking ikke påvirket proteinfunksjonen. N' mot C' terminalmerking bør evalueres.
    MERK: Ribosomene (rRNA), samt mange ribosombindende domener i ulike faktorer, er svært ladet, noe som gjør høyt ladede koder (for eksempel polyhistidin) uforutsigbare å bruke, siden det kan føre til falsk oppdagelse eller endret bindingsmodus.

2. Kulturvekst

  1. Dyrk de konstruerte gjærkulturene (basert på stammen BY4741), som inneholder de ønskede taggede proteinene, i enten flytende gjærekstrakt-peptone-dextrose (YPD)-rikt medium, eller i syntetisk dekstrose (SD) minimalt medium (1,7 g/l gjær nitrogenbase med ammoniumsulfat eller 1,7 g/l gjær nitrogenbase uten ammoniumsulfat med 1 g/l mononatriumglutamsyre, 2 % glukose og supplert med en komplett eller passende blanding av aminosyrer).
  2. Vokse 250-500 ml cellekultur til en 0,5 OD600 (midtlogg), ved 30 °C, i et passende medium.

3. Cellesamling og lysis

  1. Samle raskt celler ved vakuumfiltrering på en 0,45 μm nitrocellulose blotting membran med et glassfiltreringssystem (glassfilterholder med 1 L glasstrakt, vakuumbase og hette, rustfritt stålskjerm, pakning og fjærklemme, 90 mm; jordet kolbe 1 L).
  2. Flash fryse de oppsamlede cellene, ved å skrape pelleted celler med en spatel og umiddelbart nedsenke dem i en flytende nitrogenfylt 50 ml rør.
    STOPPESTED: Cellene kan oppbevares ved -80 °C i opptil 3–4 uker.
  3. Utfør cellelys ved kryogen sliping i en blandemølle: to ganger i 2 minutter ved 30 Hz, med 1 ml lysisbuffer (se tabell 1). Avkjøl i flytende nitrogen mellom freser.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
10 mg/ml CHX (cycloheximid) 220 0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8.0 88 20 mM
3M KCl 205.7 140 mM
1M MgCl2 26.4 6 mM
1M PMSF 4.4 1 mM
NP-40 4.4 0.10%
Protease hemmer 2 tabletter
DNase I 8.8 0.02 U/ml
Endelig volum 4,400

Tabell 1: Oppskrift på lysisbuffermasterblandingen.

MERK: Lysis buffer kan endres til å inneholde flere proteasehemmere (som bestatin, leupeptin, aprotinin, etc.) i tilfelle proteinet av interesse er svært ustabilt, men det er viktig å unngå EDTA for å opprettholde ribosomets små og store underenheter samlet under følgende trinn. Av lignende grunner må du alltid vedlikeholde minst 6 mM MgCl2 i bufferløsningen.

FORSIKTIG: HCl er svært etsende og PMSF er giftig. Bruk hansker og håndter med forsiktighet.

  1. Sentrifuge i 2 min ved 30.000 x g, 4 °C for å fjerne lysatet og samle supernatant.

4. Rensing av ribosom-nascent-kjeder komplekser for SeRP

  1. For hvert eksperiment deler du supernatanten i to deler; hver i et annet mikrocentrifugerør: total RNA-prøve (~200 μL) og immunopurifiseringsprøve (IP) (~700 μL) translatomprøver.
  2. Behandle det totale RNA-utvalget
    1. Fordøye total RNA-prøve ved hjelp av 10 U RNase I i 25 min ved 4 °C; rotere ved 30 O/MIN med et roterende miksestativ.
      MERK: Fordøyelsesforholdene kan kalibreres ved hjelp av polysomprofilering for å sikre ingen over- eller underfordøyelse av monosomer topp.
    2. Forbered sukroseputemesterblandingen som beskrevet i tabell 2.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
50% Sukrose 200 25%
1M Tris-HCl pH 8.0 8 20 mM
3M KCl 18.7 140 mM
1M MgCl2 4 10 mM
100 mg/ml CHX 0.4 0,1 mg/ml
Protease hemmer 1 nettbrett
Endelig volum 400

Tabell 2: Oppskrift på sukrose pute master mix.

  1. Legg prøven på 400 μL av sukroseputen og sentrifugen i en TLA120-rotor i 90 min ved 245 000 x g og ved 4 °C.
  2. Fjern supernatanten raskt med en vakuumpumpe og overleggspellets med en 150 μL lysisbuffer. Resuspend pellets ved å riste i 1 time ved 4 °C og ved 300 o/min.
  3. Resuspend gjenværende pellet ved pipettering og overføring til et nytt 1,5 ml rør.
    MERK: 100-200 μg totalt RNA er vanligvis tilstrekkelig for ribosomprofilering av den totale translatomen. Man kan legge til rRNA-uttømmingstrinn for å redusere rRNA-forurensning, som er den mest utbredte forurensningen av ribosom-nascent kjeder komplekser affinitetsrensinger11 (se diskusjon for ytterligere detaljer).
  1. Behandling av immunopurifiseringsprøven
    1. Vask 100-400 μL av affinitetsbindende matrise (1:1 antistoffkonjugede perler i 70% EtOH) per prøve med 3 x 1 ml lysisbuffer (uten DNase I og proteasehemmere); resuspend affinitetsmatrisen i lysisbufferen, og roter deretter ved 30 RPM med et roterende blandestativ ved 4 °C i 5 minutter. Utfelling ved sentrifugering i 30 s ved 3000 x g, 4 °C. Kast den øvre væsken. Gjenta tre ganger.
    2. Fordøye immunopurifiseringsprøver ved hjelp av 10 U per A260 nm-enhet RNase I, sammen med affinitetsbindende matrise (for eksempel 100-400 μL GFP-TRAP per prøve).
    3. Roter i 25 min ved 30 RPM med et roterende blandestativ for å binde proteinet til affinitetsmatrisen ved 4 °C.
    4. Klargjør hovedblandingen for vaskebufferen som beskrevet i tabell 3.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
10 mg/ml CHX 50 0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8.0 100 20 mM
3M KCl 233 140 mM
1M MgCl2 50 10 mM
1M PMSF 5 1 mM
NP-40 0.5 0.01%
Protease hemmer 2 tabletter
50% Glyserol 1,000 10%
Endelig volum 5,000

Tabell 3: Oppskrift på hovedblandingen for vaskebufferen.

  1. Vask affinitetsbindingsmatrisen tre ganger med 1 ml vaskebuffer, hver gang i ~ 1 min, roterer i blandestativet ved 30 RPM, ved 4 °C.
  2. Utfelling ved sentrifugering ved 3000 x g i 30 s ved 4 °C. Kast den øvre væsken.
  3. Vask to ganger til i 1 ml vaskebuffer, hver gang i 5 min, roterer i blandestativet ved 30 RPM, ved 4 °C.
  4. Utfelling ved sentrifugering i 30 s ved 3000 x g og 4 °C.
  5. Bruk 50 μL perler for protein elution med samme mengde 2x prøvebuffer. Bruk resten av perlene til RNA-ekstraksjon.
  6. Sentrifuge i 30 s ved 3000 x g, 4 °C for å pellets perlene og kaste den øvre væsken.
  7. Frys i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C. Bruk disse prøvene for etterfølgende RNA-ekstraksjon.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C over natten eller lenger. Dette kan være et stoppested.
  8. Vurder suksessen til affinitetsrensingen trinnvis ved vestlig flekk eller Coomassie-farging med aliquots (~ 10% etter volum, etter blanding) av hvert trinn. Bruk alltid mock IP på en ikke-merket WT-stamme som en kontroll for ikke-spesifikk binding til affinitetsmatrisen.
    MERK: Høy ikke-spesifikk bakgrunn kan overvinnes ved ytterligere vasketrinn med økende salt/ vaskemiddelkonsentrasjoner. Forbigående interaksjon kan stabiliseres ved ulike krysskoblingsmidler behandling, for eksempel paraformaldehyd (PFA) behandling av levende celler - legge 0,4% -1% PFA til vekstmediet i 2-5 min, etterfulgt av glycin (0,3 M) slukking i 3 min, anbefales på det sterkeste.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et mistenkt kreftfremkallende middel. Siden paraformaldehyd fordamper raskt og er etsende, arbeid i en kjemisk sikkerhetshette og bruk to lag hansker.

5. cDNA-bibliotekforberedelse for dyp sekvensering

  1. RNA-ekstraksjon
    MERK: Arbeid med RNase-frie non-stick 1,5 ml rør for å forhindre mulig RNA- eller DNA-uttømming.
    1. Tine prøvene fra trinn 4.2.5 og 4.3.12 på is og resuspendprøver med 10 mM Tris-HCl pH 7.0 til et endelig volum på 700 μL.
      FORSIKTIG: Syrefenol og kloroform er flyktige og skadelige. Arbeid i en kjemisk sikkerhetshette.
    2. Tilsett 40 μL 20% SDS til 0,7 ml Totalt RNA- eller IP-elutioner. Lukk og inverter et par ganger. Proteinutfelling bør slå prøvene hvite.
    3. Tilsett 0,75 ml forvarmet syre-fenol:kloroform til prøver. Forsegle rørene tett og rist i en termisk mikser ved 1400 RPM i 5 min og ved 65 °C. Chill prøver på is i 5 min.
    4. Sentrifuger røret fra trinn 5.1.3. ved 20 000 x g i 2 min. Overfør det øverste vandige laget til et friskt rør og legg til det 0,7 ml syre-fenol: kloroform.
    5. Inkuber i 5 min ved romtemperatur, av og til virveling. Sentrifuge i 2 min ved 20.000 x g. Overfør det øverste vandige laget til et friskt rør og legg til det 0,6 ml kloroform og virvel.
    6. Sentrifuge i 1 min ved 20.000 x g. Overfør det øverste vandige laget til et friskt rør.
    7. Utfell nukleinsyrer ved å tilsette 78 μL 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL GlycoBlue og 0,75 ml isopropanol. Virvel grundig i 5 min. Inkuber i minst 1 time ved -80 °C eller 16 timer ved -20 °C.
    8. Sentrifuge i 30 min ved 20.000 x g og ved 4 °C og kast supernatanten. Vask pelletsene med iskald 0,75 ml 80% etanol. Snu rørene for en grundig vask. Sentrifuge ved 20.000 x g i 5 min ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
    9. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s og fjern det gjenværende etanolet og kast væskene. Tørk pelletsen med åpent lokk i 5 min ved 65 °C. Resuspend prøvene som følger: for IP resuspend prøven i 10 μL av 10 mM Tris-HCl, pH 7.0. For total translatomanalyse, resuspend prøven i 20 μL av 10 mM Tris-HCl, pH 7.0.
      STOPPESTED: RNA kan oppbevares ved -80 °C i månedsvis.
  2. Kvantifisere total RNA-konsentrasjon ved fluorometri
    MERK: Alle følgende materialer og overflater skal være RNase-frie mens du klargjør cDNA-biblioteket for neste generasjons sekvensering. Bruk hansker under håndtering av RNA-prøver.
    1. Fortynn 1 μL syrefenol-ekstrahert total RNA i 9 μL av 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kvantifisere ved hjelp av et fluorometer, som instruert på produsentens nettsted.
    2. Fortynn prøvene som inneholder 50 μg RNA med 10 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      MERK: Ikke mål IP-prøver, bruk alt til neste trinn.
  3. Gel-rense ribosomet beskyttet fotavtrykk fragmenter
    1. Sett en 15% TBE-urea polyakrylamidgel og senk i 1x TBE løpebuffer. Kjør i 30 min ved 200 V før prøvelasting. Legg til 20 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer i hvert utvalg.
      MERK: Forventet båndstørrelse er rundt 25-35 nt.
    2. Tine en 10 bp DNA-stige og proteseprøver (ikke stige) ved 80 °C i 2 minutter, og slapp deretter av på isen. Last hver prøve på alle andre baner. Kjør gelen i 50-70 min ved 200 V.
    3. Fortynn 6 μL SYBR Gold (10 000 x konsentrat) i 60 ml 1x TBE buffer og flekk mens du rister i lysbeskyttede bokser i 15-20 min. Mens du flekker gelen, lag en steril skalpell og 0,5 ml gelbryterrør i merkede 1,5 ml rør.
    4. Slukk de ønskede båndene med en steril skalpell (bruk en frisk eller ren brønn mellom prøver) og legg hvert gelstykke i et gelbryterrør.
    5. Ta et bilde av gelen for å sikre at ingen prøverester er igjen i gelen.
    6. Sentrifuger rørene som inneholder kutteskiver på 20.000 x g i 5 min ved 4 °C og overfør de resterende gelstykkene fra gelbryterrøret til 1,5 ml-røret.
    7. Tilsett 0,5 ml 10 mM tris, pH 7,0. Rist inn en termisk mikser ved 1400 RPM i 10 min ved 70 °C.
    8. Overfør til en celluloseacetatkolonne med en bred borepipettespiss, og sentrifuger ved 20.000 x g i 3 min ved 4 °C.
    9. Overfør gjennomstrømningen til et nytt 1,5 ml rør og slapp av på isen.
    10. For å utfelle nukleinsyrene, legg til: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc og 2 μL GlycoBlue og virvel for å blande grundig. Plasser prøvene ved -80 °C i minst 1 time.
    11. Sentrifuge i minst 1 time ved 20.000 x g og 4 °C og kast supernatanten. Vask pelletsene med 0,75 ml iskald 80% etanol. Snu rørene for en grundig vask til pelletsene skiller seg fra bunnen. Sentrifuger igjen ved 20.000 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
    12. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s og fjern det gjenværende etanolet. Tørk pelletsene med et åpent lokk i 5 min ved 65 °C.
    13. Tilsett 15 μL 10 mM Tris, pH 7.0 og resuspend pellets grundig. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s og overfør prøven til et nytt 1,5 ml rør.
      STOPPESTED: Renset RNA kan oppbevares ved -80 °C i noen måneder.
  4. Defosforylering
    1. Bruk 3 μL av følgende blanding for hver prøve: Tilsett 1 μL RNase-hemmer i 2 μL 10x T4 polynukleotid kinase reaksjonsbuffer uten ATP. Tilsett 2 μL T4 polynukleotid kinase i hver prøve. Pipette forsiktig for å blande godt og inkubere ved 37 °C i 2 timer, uten å riste.
    2. For å inaktivere enzymet, inkubere prøven ved 75 °C i 10 minutter og spinne ned ved 450 x g, 4 °C, i 20 s. Tilsett 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0.
    3. For å utfelle nukleinsyre, tilsett 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA og 55 μL 3 M NaOAc.
    4. Virvel for å blande grundig og avkjøle prøvene ved -80 °C i minst 1 time.
      STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C over natten eller lenger.
    5. Gjenta trinn 5.3.11-5.3.13.
      STOPPESTED: Defosforylatert RNA kan oppbevares ved -80 °C i månedsvis.
  5. Kvantifisering ved hjelp av en Bioanalyzer
    1. Lag en 1:4 fortynning av hver RNA-prøve ved å blande 1 μL prøve og 4 μL DEPC-behandlet vann.
      FORSIKTIG: DEPC er et kreftfremkallende middel. Bruk hansker og arbeid forsiktig.
    2. Kjør en Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation. Følg produsentens protokoll.
      MERK: Forventet ribosombeskyttet RNA fragmentstørrelse er rundt 28-30 nt.
  6. Ligate 3' slutt med Linker-1
    1. Fortynn 5 pmol av små RNA fragmenter til 10 μL med 10 mM Tris, pH 7.0. Proteseprøver ved 80 °C i 2 minutter og kjøling på is.
    2. Forbered hovedblandingen som beskrevet i tabell 4 og bruk 29 μL per prøve.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
50 % sterilfiltrert PEG 8000 16 20%
DMSO 4 10%
10× T4 RNA ligase 2 buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-hemmer 2 2 U
10 mM adenylert linker 3-L1 0.1 25 μM
DEPC-behandlet vann 2.9
Endelig volum 29

Tabell 4: Oppskrift på 3' end ligation master mix.

  1. Tilsett 1 μL T4 RNA ligase 2 og pipette forsiktig for å blande godt. Inkuber ved 23 °C i 2 timer.
  2. For å utfelle nukleinsyrene, legg til: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL 3 M NaOAc og 2 μL GlycoBlue. Virvel for å blande grundig, og plasser prøvene ved -80 °C i minst 1 time.
    STOPPESTED: Oppbevar prøvene ved -80 °C over natten eller lenger.
  3. Gjenta trinn 5.3.2-5.3.12.
  4. Resuspend pellet i 6 μL av 10 mM Tris, pH 7.0. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og overfør prøven til et nytt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C i månedsvis.
  1. Gelrensing av 3' tilknyttede fotavtrykk
    1. Angi en 10 % TBE-urea polyakrylamidgel og senk i 1x TBE-buffer. Kjør i 30 min ved 200 V før prøvelasting. Legg til 6 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer i hvert utvalg.
      MERK: Forventet båndstørrelse er rundt 71-73 nt.
    2. Gjenta trinn 5.3.2-5.3.13.
      STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C i månedsvis.
  2. Omvendt transkribering 3ʹ sammenkoblede fotavtrykkfragmenter for å generere ssDNA
    1. Forbered en hovedblanding som beskrevet i tabell 5 og bruk 3 μL per prøve.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
10 mM dNTPer 1 0,5 mM
25 μM Linker L(rt) 0.5 625 nM
DEPC-behandlet vann 1.5
Endelig volum 3

Tabell 5: Oppskrift på omvendt transkripsjon buffer master mix før nukleinsyrer denaturering.

  1. Virvel og spinn ned prøven.
  2. Inkuber prøver ved 65 °C i 5 minutter.
  3. Chill prøver på is.
  4. Forbered en hovedblanding som beskrevet i tabell 6 og bruk 6 μL per prøve. Virvel og spinn ned prøven. Tilsett 1 μL hevet skrift III i hver prøve og pipette forsiktig for å blande godt og inkubere i 30 min ved 50 °C.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
5× FS-buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-hemmer 1 2 U
DTT 0,1 M 1 5 mM
Endelig volum 6

Tabell 6: Oppskrift på omvendt transkripsjon buffer master mix etter nukleinsyrer denaturering.

  1. Tilsett 2,3 μL av 1 N NaOH, som hydrolyserer RNA og slukker den omvendte transkripsjonen.
    FORSIKTIG: NaOH er svært korrosiv. Bruk hansker og vernebriller.
  2. Inkuber i 15 min ved 95 °C, til prøven blir rosa.
  3. Angi en 10 % TBE-urea polyakrylamidgel og senk i 1x TBE-buffer. Kjør i 30 min ved 200 V før prøvelasting. Legg til 23 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer i hvert utvalg.
    MERK: Forventet DNA-båndstørrelse er 115-117 nt.
  4. Gjenta trinn 5.3.2-5.3.12.
  5. Resuspend pellet i 15 μL av 10 mM Tris, pH 8.0. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s og overfør prøven til et nytt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C i månedsvis.
  1. ssDNA-sirkularisering
    1. Forbered følgende hovedblanding og last 4 μL per prøve, som beskrevet i tabell 7.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
10× CircLigase II-buffer 2 1x
5 M Betaine (tilleggsutstyr) 1 0,25 M
50 mM MnCl2 1 2,5 mM
Endelig volum 4

Tabell 7: Oppskrift på ssDNA circularization master mix.

  1. Tilsett 1 μL CircLigase II ssDNA-ligaer i hver prøve og inkuber i 1 time ved 60 °C.
    MERK: Effektiviteten til dette trinnet kan økes ved å legge til 1 μL CircLigase II ssDNA-ligaer i hver prøve etter 1 t inkubasjon.
  2. Inaktiver enzymet ved å inkubere ved 80 °C i 10 minutter.
  3. Kjøl deg ned på isen og fortsett til PCR-forsterkning eller oppbevar den ved -80 °C.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C i årevis.
  1. PCR-forsterkning
    1. Klargjør følgende PCR-hovedmiks og last 82 μL per prøve, som beskrevet i tabell 8.
Reagent Mengde per prøve (μL) Endelig konsentrasjon
DEPC-behandlet vann 61.6
5× Phusion HF reaksjonsbuffer 17.6 1x
10 mM dNTPer 1.8 200 μM
100 μM PCR fremover primer 0.2 225 nM
HF Phusion polymerase 0.8 1.6 U
Endelig volum 82

Tabell 8: Oppskrift på PCR forsterkning master mix.

  1. Til hvert rør som inneholder master mix, tilsett 5 μL sirkulært DNA.
    MERK: Oppbevar resten av de sirkulære DNA-prøvene ved -80 °C.
  2. Tilsett en annen 1 μL 20 μM PCR omvendt strekkodeprimer i hver prøve (se tabell 9) og virvel for å blande grundig.
  3. Aliquot hvert rør i fire separate PCR-rør, hver vil bli brukt til et annet antall PCR-sykluser.
  4. Kjør en PCR-reaksjon i henhold til følgende program, som beskrevet i tabell 10.
Sykkel Protese (98 °C) Anneal (60 °C) Forlenge (72 °C)
1 30 s
2-16 10 s 10 s 5 s

Tabell 10: PCR-program for PCR-reaksjon.

  1. Etter sykluser 8, 9, 10 og 11 fjern PCR-rør (for IP-prøver varierer syklusene fra 9 til 15) som et første forsøk. Etter hver syklus, pause programmet, ta en aliquot ut og sette den på is, og deretter raskt gjenoppta programmet.
    MERK: Antall sykluser bør justeres basert på mengden sirkulært DNA i hver reaksjon. Se figur 4 for eksempel og ytterligere avklaring.
  2. Tilsett 3,5 μL 6x DNA-lastfarge til hver 17 μL reaksjon.
  3. Tin en 10 bp DNA-stige.
  4. For størrelsesseparasjon ved gelelektroforese, senk 8% TBE polyakrylamid i 1x TBE løpebuffer og last prøvene av hvert forskjellige syklusnummer inn i tilstøtende brønner og kjør gelen i 50 min ved 180 V.
  5. Fortynn 6 μL SYBR Gold (10 000 x konsentrat) i 60 ml 1x TBE buffer og flekk mens du rister i lysbeskyttede bokser i 15-20 min.
  6. Mens du flekker gelen, lag en steril skalpell og 0,5 ml gelbryterrør i merkede 1,5 ml rør.
  7. Ta et bilde av de fargede nukleinsyrene.
  8. Klipp ønsket bånd med en forventet båndstørrelse på 174-176 bp med den sterile skalpellen og legg gelskiven i det tilberedte 0,5 ml gelbryterrøret (rengjør grundig mellom prøver og bruk RNase inaktiveringsmiddel, eller bytt til et nytt blad).
  9. Sentrifuger rørene i 5 min ved 20 000 x g og 4 °C, og overfør deretter de resterende gelstykkene fra 0,5 ml gelbryterrør til 1,5 ml-røret.
  10. Tilsett 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 og rist i en termisk mikser ved 1400 RPM i 10 min og 70 °C.
  11. Overfør den oppløste gelen til en celluloseacetatkolonne med en bred borepipettespiss.
  12. Sentrifuger søylen i 3 minutter ved 20 000 x g og 4 °C og overfør gjennomstrømningen til et nytt 1,5 ml rør og slapp av på isen.
  13. For å utfelle nukleinsyren, tilsett: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0,5 M EDTA og 2 μL GlycoBlue og virvel for å blande grundig.
  14. Oppbevar prøvene i minst 1 time ved -80 °C, eller -20 °C over natten.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C over natten eller lenger.
  15. Gjenta trinn 5.3.11-5.3.12.
  16. Resuspend i 11 μL 10 mM Tris, pH 8.0. Spinn ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s og overfør prøven til et nytt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøver kan oppbevares ved -80 °C i årevis.
  1. Kvantifisere størrelsesfordeling av Bioanalyzer
    1. Lag en 1:4 fortynning av hver prøve ved å blande 1 μL prøve med 4 μL DEPC-behandlet vann.
    2. Kjør Bioanalyzer Small RNA Chip. Følg produsentens protokoll.
      MERK: Forventet lengde er 175 ± 5 bp.
  2. Kvantifisere DNA-konsentrasjon ved fluorometer
    1. Utfør en dsDNA høysensitiv konsentrasjonskontroll med et fluorometer i henhold til produsentens anbefalinger.
    2. Multiplex- og sekvensprøver i henhold til Illumina-anbefalingene (Index Adapters Pooling Guide12).

6. Dataanalyse

  1. Utfør analysen som beskrevet i tilleggsfilen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustrert i flytskjemaet i denne protokollen (figur 1), ble celler dyrket for å logge fase, og deretter samlet raskt ved filtrering og lysed av kryogen sliping. Lysatet ble deretter delt inn i to: den ene for total ribosombeskyttet mRNA-fotavtrykk og den andre for utvalgte ribosombeskyttede mRNA-fotavtrykk, der vi utførte affinitetsrensing for å trekke ned de taggede protein-ribosom-nascent kjedekompleksene. Vi sørget for tagged proteinuttrykk og suksessen til nedtrekket ved vestlig blotanalyse, som det fremgår av figur 2. Vi validerte isolering av ribosomebeskyttede fotavtrykk, som vanligvis er 20-45 nt lange ved liten RNA-elektroforese (2100 BioAnalyzer-system), noe som muliggjør 5-10 nt skift i størrelsesdeteksjon, i henhold til systemhåndboken (figur 3). Deretter genererte vi et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering og stordataanalyse. Mens du genererer cDNA-biblioteket, vær oppmerksom på at undersykling kan føre til lavt utbytte (som det fremgår av bane 2 i figur 3), men omforsterkning er mulig for å gjenopprette det genererte biblioteket. Oversykling kan oppstå når PCR primere er utarmet, men reaksjonen fortsetter. Når dNTPer fortsatt er til stede, fortsetter reaksjonen, og genererer lengre PCR-artefakter med chimeriske sekvenser på grunn av PCR-produkter som grunner seg13 (som det fremgår av baner 3-4 i figur 3, indikert av det synlige smøret). Hvis dNTPs konsentrasjon også blir begrensende, kan det oppstå produkter som indikerer tilstedeværelsen av heteroduplexer som bare består av delvis homologe bibliotekfragmenter. Figur 4 fungerer som en referanse, med kjørefelt 2 som representerer optimal forsterkning, og bane 3 en akseptabel forsterkning. Prøver fra kjørefelt 4 og 5 (syklus 10 og 11) bør ikke brukes på grunn av muligheten for å introdusere PCR-duplikater og artefakter. Det genererte biblioteket ble ytterligere validert av høysensitiv DNA-elektroforese (det samme BioAnalyzer-systemet ble brukt) for eksakt størrelsesfordeling og kvantifisering (figur 5). Etter 3' end linker ligation, reverse transkripsjon og PCR forsterkning, en cDNA lengde distribusjon som sådan forventes, med en skarp topp rundt 175 nt.

Vi trimmet og fjernet adaptere og strekkoder fra det sekvenserte biblioteket, og bare avlesningene mellom 20 og 45 nt ble valgt for videre analyse. Figur 6 viser den resulterende lengdefordelingen. Lesningene ble delt inn i ulike grupper av: kodesekvenser, introner og intergene sekvenser (figur 7), og videre klassifisert som vist i figur 8.

Endelig analyse for deteksjon og karakterisering av samoversettelsesinteraksjoner ble utført basert på berikelse av ribosombeskyttede mRNA-fragmenter, som produserte grafene i figur 9. Vi sammenlignet det normaliserte ribosomets belegg (ved hvert nukleotid langs hver orf) av den totale translatomen med den tilsvarende valgte translatomen (nascent-interactome). Per nukleotidsammenligning eliminerer oversettelseshastighetsartefakter. Reproduserbarhet mellom biologiske reparatorer ble evaluert av Pearsons korrelasjon (terskel > 0,6). Vi presenterer selektive ribosomeprofiler, analyserer samoversettelsesinteraksjoner av Vma2p med tre proteiner: ribosomet assosiert anstand Ssb1p, Pfk2p (Fosfofructokinase) og Fas1p (Fatty acid synthase), med hvert protein C terminalt merket av GFP. Vi utførte protokollen i biologiske repliker. Figur 9 A, D og G viser den eksperimentelle ordningen for hver affinitetsrensing. Vi viser deretter ribosomets belegg av totale translatomer sammenlignet med SSB1-interaktivitet langs Vma2p-orf, koding for en underenhet av vakuolaren H+-ATPase (figur 9 B, E og H). Til slutt utførte vi ratio-basert ribosome-berikelsesprofilering (IP/Total) ved hver ribosomeposisjon i [codon/aa] langs kulen (figur 9 C, F og I). Sammenligning av de kooversettelsesinteraksjonene til disse tre proteinene med Vma2p, som syntetiseres av ribosomet, avslørte at SSB1-anstanden engasjerer den gryende Vma2p i fire forskjellige regioner langs kulen, da vi identifiserte fire betydelige berikelsestopper av SeRP. Annerledes viser Pfk2p bare en betydelig berikelsestopp, som identifisert av SeRP, i en annen posisjon sammenlignet med den medoversettelsesprest Ssb1. Analyse av Fas1-kooversettelsesinteraksjoner med nascent Vma2p oppdaget ingen betydelig berikelse. Dermed demonstrerer sammenligningen av disse forholdsbaserte berikelse ribosomeprofilene denne protokollens kraft i deteksjon og karakterisering av ulike kooversettelsesinteraksjoner i nær codon-oppløsning.

Figure 2
Figur 2: Representativt vestlig blottresultat etter affinitetsrensing av BY4741-stammen med HA-merket Naa10. Representativ vestlig blot resultat etter affinitet rensing av BY4741 belastning med HA-tagget Naa10 viser et band rundt 27.8 kDa, mens wild-type, som en negativ kontroll, viser ingen band. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativt BioAnalyzer-resultat etter fotavtrykksisolasjon og RNA-ekstraksjon med acid-fenol:chloroform, og en gjennomsnittlig størrelse på 25 nt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ gelelektroforese av PCR-forsterkning. Representativ gelelektroforese av PCR-forsterkning med baner 2-5 lastet med PCR-produkter fra sykluser 8-11, og stiger på begge sider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativt BioAnalyzer-resultat oppnådd etter opprettelsen av et cDNA-bibliotek. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Forventet lengdefordeling av avlesninger etter fjerning av adapterne med Cutadapt (fjerning av leseoperasjoner kortere enn 20 eller lengre enn 45). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Forventet samsvarsprosent for justering etter fjerning av ikke-koding RNA leser med Bowtie2 og bruker TopHat til å justere de resterende avlesningene til forskjellige organismer. Prøven ble tatt fra S. cerevisiae (en mutert variant av BY4741). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: En graf generert med RiboToolkit som representerer forventet koding kontra ikke-kodeforhold for justerte lesninger etter bruk av Bowtie2 for å fjerne rRNA-elementer i lesingene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Samoversettelsesinteraksjoner av tre forskjellige proteiner: SSB1p, Pfk2p og Fas1p med Vma2p, som syntetiseres av ribosomet, analysert av SeRP. Alle y-akser vises i lesing per million (RPM) leser. (A, D, G) Eksperimentell ordning av Henholdsvis SeRP fra Ssb1p, Pfk2p og Fas1p C terminalt merket av GFP. (B, E, H) Ribosombelegg langs orf av totale translatomer sammenlignet med henholdsvis SSB1, Pfk2p og Fas1p interaktivitet (i biologiske repliker). (C, F, I) Gjennomsnittlig berikelse av ssb1p, Pfk2p og Fas1p (IP/Total ratio) ved hver ribosomeposisjon i [codon/aa] langs henholdsvis orf. Variasjon mellom biologiske replikeringer er indikert av det skyggelagte området. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 9: 3' Linker og primersekvenser. 3' Linker L1: Linker 3-L1 med 5ʹ adenylering og 3ʹ dideoksy-cytidin unike molekylære identifikatorer ('NN ...') (RNase-fri HPLC-rensing; Omvendt transkripsjon linker: omvendt transkripsjon (L (rt)) med 5ʹ fosforert, unike molekylære identifikatorer (RNase-fri HPLC rensing); PCR fremover primer: PCRf; HPLC renset. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver protokollen Selektiv Ribosome Profilering-tilnærming for å fange co-oversettelsesinteraksjoner i nær codon-oppløsning. Når ribosomet stiger som et knutepunkt for koordinering av nascent-kjedens fremvekst i den overfylte cytoplasma, er dette en avgjørende metode for å identifisere og karakterisere de ulike kooversettelsesinteraksjonene som kreves for å sikre en funksjonell proteom, samt for å studere ulike sykdommer. Til dags dato er SeRP den eneste metoden som kan fange og karakterisere disse interaksjonene, på en direkte måte, in vivo 14,15,16.

Det første og mest kritiske trinnet er cellesamling og lysis. Det er viktig å fange, i løpet av sekunder, pågående oversettelse, ved flash-frysing etterfulgt av lysis i frossen tilstand. Celler samling må gjøres med hastverk for å unngå ribosomal avrenning samt indusere stress oversettelsesresponser, som kan oppstå raskt. Det andre kritiske trinnet er affinitetsrensingstrinnet. Det er viktig å redusere bakgrunnsbindingen ved streng vask samtidig som du sørger for at samoversettelsesinteraksjonene opprettholdes, noe som kan forenkles ved in vivo krysskobling. Siden denne protokollen er basert på den svært sensitive NGS (Next Generation Sequencing) høy bakgrunn i de første trinnene, kan forsterkes i følgende cDNA-bibliotekforberedelsestrinn, noe som fører til lave signal-til-støy-forhold.

Nuklease behandling, for å fordøye alle ikke-beskyttede mRNAer bør evalueres ved polysome profilering17 sammen med nøye evaluering av isolert ribosomal fotavtrykk størrelse distribusjon (som beskrevet ovenfor) for å unngå over eller under RNA fordøyelse. Kalibrering av nukleasekonsentrasjon og fordøyelsestider kan lette nøyaktig gjenvinning av fotavtrykk, da overfordøyelse kan føre til ribosomal rRNA-fordøyelse, noe som fører til tap av ribososombeskyttede fotavtrykk. Det er viktig å merke seg at under fordøyelsen også kan føre til lavere oppdagelsesgrad av ribosolebeskyttede fotavtrykk, som cDNA-bibliotekets forberedelsestrinn, samt dataanalysetrinn beskrevet her, kaster lange, ukarakteristiske lesninger.

Selv om rRNA-uttømming ikke alltid utgjør et kritisk skritt og ikke er obligatorisk, har det noen fordeler som renere prøver og derfor en høyere grad av genomkartlagte lesere. På den annen side er det mulighet for skjevheter, da mange rRNA-uttømmingsprotokoller også kan forårsake uttømming av de ønskede ribosolebeskyttede fragmentene. Man bør også ta hensyn til kostnadene ved rRNA-uttømmingssettene. rRNA-uttømming kan utføres etter ribbeinfotens trykkisolasjonstrinn eller etter cDNA-sirkulariseringstrinnet.

cDNA bibliotek forberedelse trinn som beskrevet her, har blitt optimalisert for lav mRNA input, som affinitet og ribosom rensing trinn sterkt redusere mRNA inngangsmengde, sammenlignet med RNA-seq uttrykk studier. Oppskalering av den første mengden cellekulturer kan i stor grad lette cDNA-bibliotekgenereringen. Alternativt kan alle valgte cDNA-bibliotekprotokoller passe med affinitetsrensings- og fotavtrykkisolasjonstrinnene som er beskrevet her. Det er viktig å merke seg at Nuclease-behandlingen som genererer ribosomale fotavtrykk krever den resulterende mRNA-endene reparasjon (cDNA bibliotek forberedelse, Dephosphorylation trinn) for å tillate følgende linker ligation trinn i cDNA-protokollen beskrevet her i din valgte protokoll.

Under sekvensering er det viktig å skille SeRP fra RNA-Seq, da de genererte bibliotekenes heterogenitet varierer sterkt, avhengig av affinitetskodede faktorer. Molekylære anstander og målrettingsfaktorer er ofte mer promiskuøse i binding, og samhandler med hundrevis eller tusenvis av underlag under oversettelse, noe som fører til svært varierte cDNA-biblioteker. Imidlertid kan svært spesifikke interagere, for eksempel kooversettelseskomplekse monteringsinteraktorer, ofte føre til generering av mye mindre varierte cDNA-biblioteker. Økning i ulike og ikke-mangfoldige biblioteker på samme bane kan i stor grad forbedre sekvensering og følge dataanalyseresultater.

Et annet unikt trekk ved SeRP er dens evne til å fange lokale variasjoner i ribosombelegg langs orf som muliggjør oppdagelsen av ribosomale skift i oversettelseshastigheten knyttet til hvert sett med interaksjoner. Det er derfor viktig å sammenligne ribosombelegg i hver codon langs kulen for å identifisere berikelse riktig. Bruk av orfs gjennomsnitt kan føre til tap av forbigående interaksjoner eller falsk oppdagelse.

Riktig bruk av SeRP-metoden åpner mange kooversettelsesveier for direkte analyse, og oppdager nye mekanistiske egenskaper samt nye ribosomrelaterte faktorer, revolusjonerer proteinbiosyntesefeltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil takke alle laboratoriemedlemmene for fruktbare diskusjoner og Muhammad Makhzumy for den kritiske lesningen av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av ISF (Israeli Science Foundation) stipend 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

Biologi utgave 176
Global identifikasjon av samoversettelsesinteraksjonsnettverk ved selektiv ribosomeprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter