Summary
在这里，我们提出了一种用于3D相关聚焦离子束铣削的管道，以指导用于冷冻电子断层扫描的细胞样品的制备。首先通过冷冻荧光显微镜确定目标荧光标记蛋白质的3D位置，然后靶向研磨。该方案适用于哺乳动物、酵母和细菌细胞。
Abstract
冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为研究天然冷冻水合状态下的细胞超微结构和分子复合物的首选方法。然而，冷冻电子断层扫描要求样品足够薄，不会散射或阻挡入射电子束。对于较厚的细胞样品，这可以通过冷冻聚焦离子束（FIB）铣削来实现。该协议描述了如何使用3D相关方法在FIB铣削过程中靶向特定细胞位点，该方法将三维荧光显微镜数据与FIB扫描电子显微镜的信息相结合。使用这种技术，可以高精度地靶向罕见的细胞事件和结构，并使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）以分子分辨率可视化。
Introduction
聚焦离子束铣削允许从冷冻固定样品制备薄生物样品，而不会出现通常与机械切片相关的问题，例如刀痕和压缩伪影1。当与冷冻电子断层扫描配对时，FIB 铣削能够以亚纳米分辨率 2,3,4 直接从细胞内对细胞形态进行高分辨率生物学研究和测定大分子复合物的结构。虽然丰富的物种，如核糖体，很容易在随机切割的FIB薄片中找到，但许多细胞过程依赖于几种复合物的共定位或定位在细胞内的特定位点。因此，需要有效的靶向，以便在铣削过程中不会失去感兴趣的生物学特征，并且仅限于随机命中。因此，需要一种将来自扫描电子显微镜（SEM）-FIB和冷冻荧光光学显微镜（FLM）的数据结合起来的相关方法。虽然只有在TEM采集5,6之后才能省略初始相关性并合并FLM和冷冻电子断层扫描数据，但荧光引导聚焦离子束铣削可以事先准确选择研磨区域，从而实现更高效的数据采集。自其概念7以来，3D相关FIB研磨在生物学研究中的应用一直受到限制，直到我们最近报道使用该技术在酵母中鉴定新的液-液相分离（LLPS）隔室8。
这里描述的是一种广义的3D冷冻相关光学和电子显微镜（CLEM）方案，可用于研究从细菌到酵母和哺乳动物细胞的各种样品。虽然实验是使用一组特定的仪器进行的，但各个步骤不受特定硬件的约束，可以很容易地转移到其他系统，作为现有协议3,5的扩展。材料表和表 1 中提供了经过测试的设备和建议设置的列表。该管道的四个关键步骤是（1）样品制备，（2）通过冷冻荧光显微镜定位感兴趣的特征，（3）3D相关聚焦离子束铣削，以及（4）定位冷冻透射电子显微镜中薄片上用于冷冻电子断层扫描数据采集的目标结构（图1）。
Protocol
图 1：包含所选关键步骤的工作流程摘要。 整个方案根据所使用的设备分为四个阶段：样品制备，包括冷冻、冷冻荧光显微镜、冷冻聚焦离子束铣削和冷冻电子显微镜。对于每个步骤，都会突出显示几个关键点。 请点击此处查看此图的大图。
1. 细胞培养和网格的冷冻
- 在进行冷冻实验之前，在室温下培养所选细胞并优化标记和处理策略。使用荧光蛋白融合或活染色（例如，Halo-Tag、LysoTracker、BODIPY、活抗体染色等）标记感兴趣的靶标。如果需要用化学或生物制剂（小分子，特殊培养基，siRNA等）进行处理以研究感兴趣的生物学过程，请使用活细胞FLM成像优化条件（例如，时间，浓度）。
- 确保使用尽可能接近后期冷冻条件（即NA、曝光时间等）的成像设置，在足够数量的细胞中成功地定位感兴趣的位点。
- 网格的选择和准备
- 选择具有适合单元格和所用基准标记的孔大小和间距的网格（请参阅步骤 1.3.1）。请勿使用无孔连续薄膜，因为这可能会导致印迹后残留缓冲液过多，从而降低玻璃化效率并妨碍基准磁珠的检测。对于细胞与网格的长时间接触，请确保网格载体和薄膜材料具有生物相容性。
- 等离子体清洁冷冻电镜网格，使其更具亲水性。为了用于贴壁细胞培养，在层流罩中用紫外线辐射对等离子体清洁20分钟后对网格进行灭菌。可选地，网格可以用有助于细胞粘附的化合物进行预处理，例如聚-L-赖氨酸或刀豆球蛋白A，如下所述。
注意：通常，以下网格/样品组合已成功用于相关的冷冻FIB工作流程：酵母：Cu或Au，200目，R1 / 4碳或SiO2 薄膜，可选涂有刀豆球蛋白A; 大肠杆菌：铜或金，200目，R1/4碳或SiO2 薄膜; 莱茵衣藻：铜或金，200目，R1/2或R1/4碳或SiO2 薄膜;HeLa：金，200目，R1/4 SiO2 薄膜，涂有聚-L-赖氨酸;HEK293：金，200目，R1/4 SiO2 薄膜，涂有聚-L-赖氨酸。 - 刀豆球蛋白A涂层改善酵母细胞的附着：
- 在含有100μM CaCl2，pH 8.5的10 mM HEPES缓冲液中制备1 mg / mL刀豆球蛋白A的涂层溶液。将一滴（50μL）涂层溶液和两滴蒸馏水分别放在一块石蜡膜上。
- 用反向力镊子拿起等离子清洁的网格，并将其小心地插入涂层溶液的液滴中，避免垂直于网格移动以防止损坏薄膜。
- 孵育~5秒后，以类似的方式将其插入水滴中，洗涤网格两次。最后，通过在网格背面涂上滤纸来吸干多余的液体，让网格完全干燥，然后再将其从镊子中释放出来。使用干燥的网格进行冷冻。
- 用于悬浮培养和贴壁细胞的聚-L-赖氨酸包衣：
- 在 pH 8.5 的 0.1 M 硼酸钠缓冲液中制备 1 mg/mL 聚-L-赖氨酸的涂层溶液。
- 将血浆清洁的网格放入合适的培养皿中进行细胞培养，并通过紫外线辐射灭菌20分钟。
- 轻轻加入足够的涂层溶液以覆盖所有网格，并在37°C下孵育至少2小时。吸出液体并用PBS轻轻洗涤网格两次，然后将细胞接种到所需浓度。
- 电池和基准磁珠的制备
注意：荧光数据的3D配准需要在FIB / SEM显微镜中拍摄的图像进行基准珠，以允许3D相关FIB铣削。- 选择在所有成像模式下可识别的磁珠，即 FLM、SEM 和 IB（推荐直径 0.5-1 μm），但要确保它们在荧光成像过程中不会超过细胞靶标结构，以便更容易区分磁珠和感兴趣的生物学特征。按照制造商的指示去除基准珠中的细胞毒性防腐剂（例如 NaN3）。
注意：为了更容易区分感兴趣的生物学特征和基准点，如果荧光发射光谱仅部分重叠，以便可以根据FLM通道中的强度差异区分信号，则很有用。 - 如果使用悬浮培养物，则将细胞生长到合适的密度（例如，酵母OD600 = 0.8，大肠杆菌OD 600 = 0.8-1.0，莱茵梭菌1500个细胞/μL），并根据实验需要进行处理，例如更换培养基，添加化学物质，饥饿等。根据插入方法（手动/自动）的要求将血浆清洁的网格连接到镊子上，并将 4 μL 细胞悬液与 ~1 x 105 磁珠/μL 基准珠悬浮液混合到网格的薄膜侧。
注意：在滴定实验中确定细胞和基准点的最佳稀释度（例如，通过检查冷冻FLM或FIB / SEM，见下文）。然而，对于大多数悬浮生长的细胞，最终浓度为~1 x 105 μL的1 μm基准磁珠（1：20稀释;详见 材料表 ）已被证明是一个很好的起点。 - 如果使用贴壁培养，则使用紫外线辐射对网格进行血浆清洁和灭菌以进行无菌培养。如有必要，用有助于细胞粘附的化合物（例如，聚-l-赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白;参见步骤1.2.2）预涂网格。在正常培养皿或带有网格细分的培养皿中的网格上播种和培养细胞。
- 根据需要处理样品，并将细胞保持在最佳状态，直到低冷冻（例如，HEK / HeLa的37°C / 5%CO2 ）。小心地从培养皿中取出网格，并将它们连接到插入的镊子上。将 4 μL 与基准面混合的培养基（1 μm 基准点为 1 x 105 个珠子/μL）施加到细胞承载侧。
- 选择在所有成像模式下可识别的磁珠，即 FLM、SEM 和 IB（推荐直径 0.5-1 μm），但要确保它们在荧光成像过程中不会超过细胞靶标结构，以便更容易区分磁珠和感兴趣的生物学特征。按照制造商的指示去除基准珠中的细胞毒性防腐剂（例如 NaN3）。
- 使用手动或自动冷冻程序将细胞浸入冷冻。如果可能，仅从与细胞相对的一侧吸干网格，以防止机械损坏细胞（图2A）。在双臂自动浸入系统上，通过将聚四氟乙烯（例如特氟龙）片而不是吸墨纸放在面向细胞的垫子上来实现这一点。将网格转移到储物箱中，并将其保存在液氮（lN2）中直至使用。
注意：lN2 和其他制冷剂会对眼睛和皮肤造成严重损害。使用个人防护装备（PPE），只能在通风良好的空间工作，以避免危险的N2 浓度的积聚。
注意：所有后续步骤最好在lN2 的液相中进行，以避免污染电池和薄片表面，因为这可能会使下游处理复杂化。通过始终使用干净的液氮（例如，过滤器去除浮冰），消除不必要的转移步骤，并在可能的情况下在湿度受控的环境中工作，减少与漂浮冰晶的接触。 - 在AutoGrids中安装和夹住切口和细胞朝上的切入冷冻网格（图2A），以进行随后的冷冻荧光成像和FIB铣削。为了确保样品在TEM中正确对齐，研磨方向需要与冷冻电子断层扫描倾斜轴正交。因此，在削波之前，将方向标记（例如，激光雕刻或可移动标记点）放在AutoGrids上，以帮助进行这种对齐（图2A）。
- 在冷冻FLM和FIB / SEM上筛选网格质量（图2B）。 优化细胞密度、印迹时间和力度，以获得细胞和磁珠的均匀分布。在冷冻荧光显微镜上使用反射光成像或使用冷冻FIB-SEM来确保细胞和基准磁珠清晰可见（图2B，白色箭头）。
- 如有必要，在更好的条件下重复浸入，例如，改变细胞浓度和/或印迹时间。一旦找到合适的跳入参数，不要对每一轮新实验重复网格筛选。
图 2：使用 SEM 和 IB 筛选合适的 网格。 （A） 方向标记应放置在垂直于铣削方向的自动网格上，以简化正确加载到 TEM 中。电池面朝上安装在组装的自动网格中。（B）切入冻结后，在SEM中检查网格以评估和优化切入条件：a）每个网格不应有太多单元。例如，对于HeLa细胞，不要使用超过1-4个细胞/平方。对于较小的细胞，如 酿酒酵母 （如图所示），已经发现4-6个细胞团块是有用的。b） 基准珠（白色箭头）应清晰可见，细胞周围不应有太多缓冲液。 请点击此处查看此图的大图。
2. 冷冻荧光光学显微镜
- 对于每个网格，获取（宽场）荧光和微分干涉对比（DIC）或反射模式的概览，并选择合适的带有荧光信号的网格方块。选择包含感兴趣单元格和足够数量的基准标记 （6-12） 的视图字段。
- 确保细胞和磁珠均匀分布，不要太密集，并且朝向每个正方形的中心。仅选择FIB-SEM和TEM仪器均可访问的正方形，因此在200个网格上，这些正方形距离网格边缘至少三个正方形（图3A，红色圆圈内）。
- 在每个选定的网格方块上，获取一个荧光堆栈，其聚焦步长适合以后的反卷积，即轴向分辨率限制的<1/2。如果可能，使用高数值孔径（NA）物镜来提高光子计数和定位精度。
- 在NA 0.9物镜的共聚焦显微镜中，获取步长为300 nm的堆栈，对奈奎斯特值进行过采样。如果需要，记录多个颜色堆栈（图2B）。将网格存储在lN2 下，直到进一步使用。
注意：要确定最佳步长，请选择显微镜控制软件计算的值或使用在线工具9.检查通道之间的信号渗漏，因为过度的渗漏不利于共定位实验。但是，有些可能有利于校正多色堆栈中的色差。
- 在NA 0.9物镜的共聚焦显微镜中，获取步长为300 nm的堆栈，对奈奎斯特值进行过采样。如果需要，记录多个颜色堆栈（图2B）。将网格存储在lN2 下，直到进一步使用。
- 使用适当的软件10,11 对堆栈进行反卷积，如果需要各向同性像素大小，则重新切片7。反卷积 - 就像在室温下一样 - 清除FLM信号并可能提高定位精度（图3C）。
图 3：选择 FLM 堆栈采集的方块并通过反卷积改进数据。 （A）用表达eGFP-Ede1（绿色）和mCherry-Atg8（洋红色）的酵母细胞组成的网格概述。选择珠子和细胞分布良好的位置，但避免网格边缘（红色阴影）。这些框表示具有良好细胞分布的位置，其中进行了荧光堆栈。（B）反卷积后在黄框正方形（从A开始）上拍摄的多色堆栈的最大强度投影（MIP）。FLM 堆栈的反卷积可显著清除不需要的背景信号，并有助于更准确地定位 z 中的磁珠，从反卷积 （C） 之前和之后的高斯拟合中可以明显看出（拟合在 3DCT 中进行，并显示标有 1 的磁珠）。图像显示了红色通道的放大MIP视图（激发：552 nm，发射：585-650 nm）。请点击此处查看此图的大图。
3. 聚焦离子束铣削
- 将网格加载到冷冻FIB-SEM仪器中，并使用切口和/或方向标记以确保正确定向，以便以后放置在TEM中（图2A）。确保铣削方向垂直于透射电镜的倾斜轴。
- 使用气体注入系统（GIS;CpMePtMe3）在FIB-SEM设置预定义的载物台位置，用保护性有机金属层涂覆网格。不要应用太多，因为这可能会干扰以后TEM中的基准磁珠定位。使用等离子镀膜机涂覆金属铂以减少样品充电。
注意： 如果没有可用的 GIS 涂层设置，则可以通过执行连续几轮短涂层 （~2 s） 然后进行 FIB 铣削来轻松找到它们。确保样品仍然可以在中等电流（~100 pA）下成功切割，而不会在薄片边缘周围的保护性有机金属层出现明显的边缘。GIS指针的时间和距离（相对于样品）都是需要考虑的重要参数。请勿在室温设置（即 45 °C）下操作 GIS 针，但应尽可能冷，以提供均匀的涂层 （25-27 °C）。 - 记录SEM网格概述并与FLM网格执行2D关联，以查找已记录荧光堆栈的网格正方形。手动检查两个视图或使用各种软件包7、10、12 来查找网格正方形。此处的重点是 3D 相关工具箱 （3DCT）7，它使用 3D 刚体变换和视图之间的各向同性缩放。有关 3DCT 功能的出色演练可在线获得13。
- 在 FLM 和 SEM 网格概览（右键单击）中选择并标记至少四个相应位置，例如网格条或支撑膜中的孔等地标，并计算标记点之间的转换（相关）。
- 接下来，将标记放置在已获取 FLM 堆栈的相应网格正方形的中心，并预测它们在 SEM 视图中的位置（相关; 图 4A）。
- 对于每个相关的网格正方形，在所选的FIB铣削角度（45°预倾斜穿梭车为10°-25°）拍摄低电流（≤10 pA）离子束（IB）图像。选择与荧光数据匹配的视野（即位置和放大倍率）。对于200个网格，获取荧光和FIB / SEM数据以包含单个网格正方形，包括网格条（参见图3A和图4A）。
注意：研磨应以尽可能浅的角度进行，以避免在冷冻电子断层扫描过程中失去显着的角度范围，并允许识别足够数量的基准磁珠。例如：载物台倾斜为 17°、穿梭预倾斜为 45°，FIB 光束相对于直线倾角为 52°，薄片预倾斜为 10°，刚好满足 TEM 中 ±60° 的首选角度范围，从 -50° 倾斜到 +70°，这是许多 TEM 低温支架的最大值。 - 拍摄同一正方形的SEM图像，以帮助识别荧光和离子束视图中的相应磁珠。
- 使用3DCT对去卷积的3D FLM堆栈和每个位置的2D离子束视图进行配准，如以下（图4B）步骤中所述。
- 在 3DCT 中加载相应的重新切片的 3D FLM 堆栈和离子束 （IB） 视图。
注意：多色荧光数据最多可以作为三个单独的单通道堆栈文件加载。 - 在荧光数据中选择 4 个基准磁珠，然后右键单击位置列表，通过对 x、y 和 z 信号的高斯拟合 来确定 它们的 3D 位置。在IB图像中选择相应的磁珠并执行初始3D相关（相关）。
- 在荧光图像中迭代添加更多磁珠，优化其3D位置，并预测其在IB视图中的位置，以快速将更多磁珠添加到配准中并检查相关性的准确性。在 3DCT 中，提供均方根误差 （RMSE） 值以评估相关性一致性7.
- 确保RMSE值较小，并且与定位精度（~300 nm）一致。为了确定相关性的准确性，在配准步骤中故意省略一些在荧光和离子束中清晰可辨的基准磁珠。通过检查它们在离子束图像中的预测位置与实际位置来做到这一点。如果预测位置与实际位置明显不同，则使用一组新的基准点重复初始相关性。
注意：关联 6-8 个磁珠已被证明足以准确配准 FLM 堆栈和 IB 视图。但是，在较宽的 z 值范围内添加更多基准点（最多 12-15）（例如，通过在网格条或相邻正方形中选择磁珠）可能会提高相关性的准确性。
- 确保RMSE值较小，并且与定位精度（~300 nm）一致。为了确定相关性的准确性，在配准步骤中故意省略一些在荧光和离子束中清晰可辨的基准磁珠。通过检查它们在离子束图像中的预测位置与实际位置来做到这一点。如果预测位置与实际位置明显不同，则使用一组新的基准点重复初始相关性。
- 选择目标蜂窝信号，在 FLM 堆栈中拟合它们的 3D 位置，并应用变换来预测 IB 视图中的目标位置（图 4B）。
注意：FLM头寸列表中的任何条目，如果IB列表中没有对应项，将被视为待预测的信号。
- 在 3DCT 中加载相应的重新切片的 3D FLM 堆栈和离子束 （IB） 视图。
- 对于每个相关的正方形，将感兴趣特征的预测位置转移到FIB-SEM仪器并放置薄片铣削图案（图4C）。手动传输位置（例如，通过测量到可见地标的距离，例如单元或基准磁珠）或使用自动化和脚本，例如在 SerialFIB14 中实现。如果每个单元有多个信号，则放置图案以在同一薄片中包含尽可能多的兴趣点 （POI），以提高吞吐量。
- 首先粗磨，然后将薄片细磨至最终厚度为150-250nm。避免导致薄片下垂的步骤（例如，应力消除切割15），从而导致感兴趣的实际特征相对于先前获得的FLM堆栈移动。使用手动3 或自动14,16,17,18 FIB 铣削程序。无论使用哪种方法，都可以通过从顶部和底部对称地变薄来确保感兴趣的特征保持在薄片的中心。
- 要评估每个薄片的铣削精度，请执行与步骤 3.4 中相同的配准。但是，这一次，使用FIB铣削后的最终IB图像，并检查感兴趣特征的预测位置是否包含在最终薄片中。或者，将从3DCT的输出和自定义脚本19获得的FLM堆栈的旋转投影与最终IB图像叠加（图4C，小插入）。
图 4：3D 相关 FIB 铣削过程 。 （A）网格的FLM（左）和SEM（右）概述的2D-2D相关性用于定位先前拍摄荧光堆栈的网格正方形。（B）对于每个选定的正方形，在3DCT（彩色框）中对相应的基准位置进行3D-2D配准后，在FLM数据中选择感兴趣的生物学特征位置。根据离子束图像中相应位置的预测（红色圆圈），选择薄片制备的位点。（C）扫描电子显微镜（SEM）和离子束（IB）图像用于在铣削过程中保持目标居中。已经发现 150-250 nm 的最终厚度足以进行进一步的下游加工。 请点击此处查看此图的大图。
4. 相关透射电镜
- 将网格加载到TEM中，确保薄片方向（从切口或方向标记中明显看出）垂直于倾斜轴。
注意：可以使用各种软件控制不同制造商的显微镜，例如Tomo5，TOM或SerialEM20。在这里，重点是后者。 - 获取包含薄片的每个网格正方形的网格蒙太奇和概览。确保放大倍率和曝光时间适合在TEM图像中可视化基准磁珠，而不会显着增加总电子剂量。获取每个薄片的高分辨率TEM贴图（蒙太奇）。
- 寄存器和 3D-2D 将 FLM 堆栈与 3DCT 中的 TEM 网格正方形和薄片轮廓相关联。使用与步骤3.6中描述的相同的步骤，在荧光（x，y，z-高斯拟合）和透射电子显微镜图像中选择相应的磁珠位置。然后，在 FLM 通道中选择感兴趣的位置并将其传输到 TEM 概览。如有必要，使用两步程序，包括FLM和低放大倍率TEM之间的第一个相关性，以及从低倍率到高放大倍率TEM的第二个相关性（图5）。
- 手动（通过测量到地标的距离）、SerialEM20 中提供的配准和地图工具或外部软件（如相关器21）传输位置。
- 在相关位置设置和运行倾斜系列。使用适当的放大倍率、散焦和总剂量（详见 材料 表和 表1 ）。在由薄片确定的预倾斜处开始采集（另见步骤3.4中的注释）并使用剂量对称倾斜方案22。使用手动或批量采集。
图 5：TEM 中相关位置的定位。 在成功进行 3D 相关 FIB 铣削并转移到透射电子显微镜后，对 FLM 堆栈中的基准珠（彩色框）和 TEM 概述之间的每个铣削正方形进行 3D-2D 配准，以定位冷冻断层扫描的潜在位点（红色圆圈）。然后可以获取更高放大倍率的薄片概览（放大），以更精确地设置断层图。 请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
该协议提供了用于发现含有EH结构域和内吞蛋白1（Ede1）依赖性内吞蛋白沉积物（END）及其在自噬体中的降解和捕获的管道的演练8。END是 酿酒酵母中的液-液相分离隔室，可在内吞事件失败后缓冲参与网格蛋白介导的内吞作用（CME）的各种蛋白质。它的主要成分之一是Ede1，它兼作CME组分和选择性自噬受体，用于降解这种新的LLPS隔室。因此，在醇脱氢酶（ADH）启动子的控制下，Ede1（EGFP-Ede1）的EGFP融合用于可视化ENDs，因为Ede1过表达会干扰内吞作用的早期阶段，因此组成性诱导LLPS。
在具有EGFP-Ede1过表达酵母细胞和1μm基准标记物的深度冷冻网格上，选择五个位置进行GFP通道中的FLM堆栈采集（图6A;TFS Corrsight;共聚焦模式，300 nm 聚焦步长，10 μm 范围）。将网格转移到FIB仪器（Quanta 3D FEG），并通过对荧光和SEM网格概述进行2D-2D相关性来识别已获取FLM堆栈的网格正方形（比较步骤3.2）。
对于每个选定的方块，在低电流（10 pA，1200倍放大倍率）下拍摄离子束图像，并在3DCT中记录相应的基准位置。在选择具有感兴趣的生物学特征的位置并将其拟合在FLM堆栈中的3D位置后，将发现的变换应用于推定的END位置，并选择用于薄片制备的位点（图6B）。此处所示的示例使用了相对于网格表面倾斜11°的FIB梁（45°FIB穿梭预倾斜;18°载物台倾斜）。通过测量预测位置相对于FIB图像中突出地标（例如，孔，冰污染，基准珠）的距离，转移感兴趣的位置，并手动绘制FIB图案（图6D）。通过故意省略可以在FLM和IB图像中清晰识别的珠子，然后比较它们在离子束视图中的实际位置和预测位置（例如，图6B，C中的钻石）来评估配准的准确性。发现图6C所示正方形的相关性是准确的（即，FLM磁珠位置的预测位置与其相应的IB位置完全一致，并且3DCT报告的配准子像素RMSE值完全一致）。因此，在预测位置（站点B）切割薄片并精细铣削至~200nm的厚度（最终图案偏移）。
图 6：酵母中内吞蛋白沉积物 （END） 的 3D 相关靶向的代表性结果。 （A）铣削前网格的SEM概述。彩色框表示事先采集荧光堆栈的网格方块。（B-C） 网格正方形中的 3D 相关性。在 FLM 数据（B，此处显示为最大强度投影）和离子束图像 （C） 中记录了几个相应的基准珠（彩色框）后，通过预测钻石指示的珠子的位置来验证 3D 配准的准确性。接下来，在离子束视图中预测两个潜在铣削位点的目标信号位置（红色圆圈）。（D） 站点 B 的放大，显示三个目标点（红色圆圈）和初始铣削模式（黄色框）的预测位置。据预测，第四个荧光点远低于另一个点，因此在铣削过程中没有靶向（灰色圆圈）。请点击此处查看此图的大图。
在成功进行FIB铣削并将网格转移到冷冻透射电子显微镜（Titan Krios在300 kV下运行并配备Gatan K2直接电子探测器和生物量子能量过滤器）后，在SerialEM中记录了网格概述，并用于定位带有薄片的正方形。对于每个薄片，采集概览图像，并使用相应的基准磁珠在3DCT（3D-2D）中记录FLM数据。然后使用从基准磁珠计算的变换来预测感兴趣的生物学特征的位置（图7A）。在较高放大倍率下记录的薄片概览被缝合，并使用清晰可见的地标（例如，基准珠）关联感兴趣的位点。或者，经典的光电联用显微概述可以在各种软件10,12中生成。
基于相关性，为图7A所示的薄片找到了四个潜在的断层扫描采集位点。然而，这也包括在3D相关FIB铣削过程中未瞄准的位置（比较图6D;灰色圆圈）和被冰污染阻塞的位置（图7;灰色框）。因此，只能记录两个位置的断层扫描（图7B）。总体而言，在预测位点发现了~75%的相关成功率，即在转移到TEM和END结构后幸存下来的薄片（12个相关位点）。在断层扫描重建、分割和模板匹配之后，可以在其原生上下文中可视化单个 END 结构（图 7C，D）。这包括围绕END的开窗内质网（ER），偶尔接触的脂滴和核糖体，这些核糖体被排除在LLPS隔室之外。综上所述，这显示了3D相关FIB铣削如何从完整细胞中提供稀有生物过程的分子水平信息。
图 7：使用冷冻电子断层扫描可视化 END 的代表性结果。 （A）图 6 所示铣削部位的低放大倍率TEM概览可以很容易地与FLM最大强度投影（图6B）相关联，以定位感兴趣的生物学特征（红叉）。（B）在第二步中，可以关联更高的放大倍率（拼接）视图，并设置断层扫描采集的位置（黄色框）。由面外信号（灰色框，比较 图6D）产生的位置被忽略。（中四）使用这种3D相关FIB方法，可以在其天然环境中可视化内吞蛋白沉积物（END）。可以识别和可视化内质网 （ER）、核糖体、膜和脂滴等结构。 请点击此处查看此图的大图。
| 等离子清洗器设置 | |||
| 哈里克等离子清洁器 PDG-3XG ： | 射频信号：“HI”，30 秒;N2 等离子体 | ||
| 柱塞设置 | |||
| TFS Vitrobot Mk IV： | 100%湿度;印迹力 = 8;印迹时间= 10秒;等待时间 0 秒;（这应该适用于大多数悬浮细胞和贴壁细胞） | ||
| FIB GIS 位置和时序 | |||
| 广达三维有限元： | 倾斜 = 0，旋转 = -180，Z 位置 = 13.5，温度设定点 =26.15°，时间 = 8 s | ||
| TFS Scios： | 倾斜度 = 0，旋转 = -180，Z 位置 = 9.8，温度设定点 =28° C，时间 = 7 s | ||
| TFS Aquilos 1： | 软件预定义位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 s | ||
| TFS Aquilos 2： | 软件预定义位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 s | ||
| FIB 溅射镀膜机设置 | |||
| 法定人数制度： | 在仲裁准备室中：10 mA，40 s | ||
| TFS Scios： | 10 瓦， 500 V， 250 毫安， 0.2 毫巴， 15 秒 | ||
| TFS Aquilos 1： | 1kV， 10 毫安， 10 帕， 15 秒 | ||
| TFS Aquilos 2： | 1kV， 10 毫安， 10 帕， 15 秒 | ||
| 断层扫描采集 | |||
| 泰坦克里奥斯 Gi2 | K2相机，加坦生物量子能量过滤器 | ||
| 20 eV 狭缝;剂量对称倾斜方案（哈根），步长为 2°;从 +10° 开始（薄片预倾斜！） 至 +70° 和 -50° | |||
| 泰坦克里奥斯 Gi4 | 猎鹰4号;选择器X能量过滤器 | ||
| 10 eV 狭缝;剂量对称倾斜方案（哈根），步长为 2°;从 +10° 开始（薄片预倾斜！） 至 +70° 和 -50° | |||
| FLM收购 | |||
| 对视镜（共聚焦模式） | 目标：蔡司EC计划-新氟40×/0.9 NA Pol;堆栈采集参数：x-y 像素大小 = 161.25 nm，z 步长 = 300 nm。 | ||
| 徕卡SP8冷冻共聚焦 | 物镜：徕卡 HCX PL APO 50x / 0.90 光电联用显微;堆栈采集参数：x-y 像素大小 = 84 nm，z 步长 = 300 nm。 | ||
表 1：测试设备列表和建议设置。
Discussion
1. 协议中的关键步骤
优化细胞培养和网格插入参数是该工作流程的基础。在项目开始时，值得投入时间来优化标记策略、细胞和基准磁珠的分布，并测试不同的网格制备和印迹参数。使用最佳冷冻样品将大大促进下游处理。
对于任何TEM实验，都需要玻璃样品。对于大型哺乳动物细胞，如HeLa，每个网格平方1-2个细胞是优选的，但细胞在更高的密度下可能仍然是玻璃体的。任选地，通过在将2.5-10%（v / v）甘油与加入培养基中的2.5-10%（v / v）甘油孵育10分钟，可以改善哺乳动物细胞（例如HEK293，HeLa）中的玻璃化。如果可用，可以使用网格图案来确保细胞的完美放置和分布，从而改善玻璃化和以后的相关性24。
虽然可以在工作流程中选择特定的细胞，但显示目标生物学特征的细胞太少会显着降低整体通量。为了提高POI阳性细胞的相关性，应使用足够明亮的荧光团。这在内源性表达水平上尤其重要。我们发现，在低温条件下，mVenus的性能通常优于EGFP，因为它增加了亮度25 和恒温色位移，使其适用于低温条件下的标准GFP过滤器设置26。对于非点状目标结构，还应考虑波长和定位精度（阿贝衍射极限）之间的权衡。
高效的3D相关还要求网格机械稳定，并且处理得非常小心。虽然可以使用带有碳支撑的标准金或铜网格，但根据项目的不同，使用更坚硬的SiO2 薄膜可能会显着提高成功率。然而，尚未最终确定（a）机械稳定性或（b）匹配热膨胀系数（基材与薄膜）以减少低温起皱27是成功3D相关的最关键因素。此外，为了拾取脆弱的金网格，可以使用聚二甲基硅氧烷涂层的培养皿5。
除了确保样品稳定性外，还需要仔细选择FLM成像参数，以获得适合在FIB铣削过程中实现最佳靶向的高质量荧光堆栈。在这方面，还建议在FLM数据上测试不同的去噪28 或反卷积技术，因为它可以显着改善基准点和蜂窝信号的定位。当将荧光信号与FIB-SEM图像相关联时，对基准磁珠进行良好的采样非常重要。它们应该很好地分布在细胞周围，并且可能在不同的z高度。通过检查故意排除在基准模型中但可以通过肉眼明显关联的磁珠的预测位置与实际位置来验证相关性的一致性也是一种很好的做法。还应始终考虑3DCT的RMSE值，以检查配准一致性。
由于从FIB-SEM室中沉积研磨材料和残留水（即再污染）通过向薄片的两侧添加无定形材料来增加有效薄片厚度，因此由于额外的电子散射事件，将精细铣削的薄片长时间保存在显微镜中通常会降低TEM数据质量。因此，铣削通常以两步方式进行：首先，对所有位置进行粗略铣削（即，铣削至约800nm），然后精细铣削（至~150-250nm），并在最后一个薄片完成后立即卸载网格。然而，通过以现场方式处理感兴趣的位置，可以获得更好的相关成功，从而直接在同一薄片上进行粗铣和精铣，因为这没有时间弯曲或变形。然而，这减少了每个网格可以产生的最大薄片数量，具体取决于系统的再污染率。对于 20 nm/h 的速率，在 1-1.5 小时内产生 4-6 片。
整个网格或粗磨薄片>300 nm的移动将导致相关性差或不成功（另请参阅下面讨论的限制）。因此，应定期检查，例如，通过比较FIB铣削之前，期间和之后的IB图像。显示明显运动（>300 nm）的位点应丢弃。优化样品制备（即网格类型、池密度和切入参数的选择;参见协议第 1 节）和研磨策略以避免这些移动。通过步骤3.6中所述的逐地铣削和减小薄片宽度，可以显着减少薄片弯曲。如前所述，虽然应力消除切割15 的设计是为了减少薄片弯曲，但它们通常会导致解耦薄片的协同运动，从而有效地防止相关性。集成的FLM系统可用于解决此问题。
2. 方法的修改和故障排除
强烈建议在进入冷冻条件之前在活细胞成像中对样品进行彻底表征。优化细胞样本、治疗方案，并在进入冷冻工作流程之前了解预期信号类型，可以显著提高其成功率。
在这里介绍的工作流程中，使用带有冷冻载物台的独立荧光显微镜对样品进行成像，然后将网格转移到聚焦离子束显微镜中。然而，它已经在将荧光显微镜集成到FIB-SEM室中的系统上进行了测试，因此不需要样品转移即可获取荧光图像29,30,31。使用这种集成系统，可以在FIB铣削期间和之后对感兴趣的位置进行成像，以检查目标荧光信号的存在，而不会增加污染最终薄片的风险。然而，重要的是要记住所用显微镜的光学参数，因为例如，低数值孔径物镜会限制基准磁珠和目标信号的定位精度。尽管如此，集成的 FLM 设置也将有助于更好地处理网格和薄片的轻微变形，因为 FLM 堆栈可以不断更新并与最新的 SEM 和 IB 视图进行比较。
作为FIB铣削和TEM数据采集之间薄片荧光成像的替代方案，TEM后相关性可用于验证薄片5,6的正确放置和铣削。
在相关工作流程的所有步骤中，尤其是在TEM期间，建议在FIB-SEM / TEM图像上创建投影荧光数据的叠加。这种经典的光电联用显微视图有助于更直观地了解细胞的哪一部分包含在薄片内。这也可以作为验证相关性准确性的有用健全性检查。
3. 方法的局限性
3D 相关 FIB 方法需要可提供基准磁珠的样品。因此，这种方法目前仅限于切入式冷冻网格。对于高压（HPF）冷冻（组织）样品，目前只能执行2D-2D相关。潜在的，内部基准标记物（例如，细胞器，染色的脂滴）可能是这个问题的解决方案32,33。最终的相关成功率取决于许多因素，包括样品质量、荧光显微镜设置、薄片厚度和目标结构的大小。在最终IB图像上，使用所述3D配准方法的相关精度估计在200-300nm的范围内，大致对应于FIB铣削薄片7的典型厚度。因此，比这小得多的细胞结构目前很难靶向。此外，铣削部位（>300 nm）的过度移动也会降低相关性的准确性，这个问题可以通过集成到FIB/SEM仪器中的FLM设置来解决。在任何情况下，在铣削过程中表现出强烈变形或弯曲的薄片都应排除在下游工作流程之外。
总体而言，冷冻荧光成像目前受到阿贝衍射准则的限制。随着超分辨冷冻FLM方法的更多常规应用（和商业化），更准确地靶向细胞结构成为可能，特别是当集成到FIB / SEM中进行即时操作时。
4. 方法的意义
特别是与非靶向和后相关技术相比，3D 相关 FIB 铣削方法允许在耗时和资源消耗的 TEM 步骤之前选择合适的位置。因此，它能够更有效地收集和项目规划。此外，相关的荧光数据增加了一层信息，这对于解释断层图和将冷冻断层扫描结果整合到多尺度项目中至关重要，特别是在处理非结构化蛋白质组装体或模板匹配和断层图平均太小的蛋白质组装体时。
5. 重要性和潜在的未来应用
结合先进的工作流程，例如 HPF 样品 34,35、冷冻 FIB-SEM 体积 36 和超分辨率荧光成像26、37、38,39,39,3D 靶向薄片制备不仅提供了解剖分离细胞中的生物过程的前景，而且还使组织和患者样品可用于 FIB 铣削和冷冻电子断层扫描。因此，它将允许以高分辨率解剖病理过程，从而成为纳米级活检不可或缺的基石。
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Inga Wolf支持IT基础设施，Florian Beck提供计算支持，感谢Oda H. Schiøtz对手稿的批判性阅读。资金部分来自Philipp S. Erdmann的Alexander von Humboldt回归者奖学金和Florian Wilfling的EMBO长期奖学金ALTF 764-2014。Anna Bieber得到了勃林格殷格翰基金会博士奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
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