Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, ein Modellsystem für die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Gemeinschaften der Mukoviszidose der Atemwege zu entwickeln. Künstliches Sputummedium emuliert die Zusammensetzung von Sputum, und hyperoxische Kulturbedingungen modellieren die Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf mikrobielle Lungengemeinschaften.
Abstract
Es wird angenommen, dass mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Mukoviszidose (CF) und anderer chronischer Lungenerkrankungen spielen. Mikroben wurden traditionell aufgrund ihrer Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, klassifiziert. Zusätzlicher Sauerstoff ist eine gängige medizinische Therapie, die Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) verabreicht wird. Bestehende Studien zu Sauerstoff und dem Mikrobiom der Atemwege haben sich jedoch darauf konzentriert, wie hypoxie (sauerstoffarm) und nicht Hyperoxie (hoher Sauerstoffgehalt) die überwiegend aeroben und fakultativen anaeroben mikrobiellen Lungengemeinschaften beeinflusst. Um diese kritische Wissenslücke zu schließen, wurde dieses Protokoll unter Verwendung eines künstlichen Sputummediums entwickelt, das die Zusammensetzung von Sputum aus pwCF nachahmt. Die Verwendung der Filtersterilisation, die ein transparentes Medium ergibt, ermöglicht optische Methoden, um das Wachstum von einzelligen Mikroben in Suspensionskulturen zu verfolgen. Um hyperoxische Bedingungen zu erzeugen, nutzt dieses Modellsystem etablierte anaerobe Kultivierungstechniken, um hyperoxische Bedingungen zu untersuchen; Anstatt Sauerstoff zu entfernen, wird den Kulturen Sauerstoff zugesetzt, indem täglich Serumflaschen mit einer Mischung aus komprimiertem Sauerstoff und Luft geschont werden. Sputum von 50 pwCF wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden täglich gespart, um die Fähigkeit dieses Modells zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Sauerstoffbedingungen zu überprüfen. Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurde an kultivierten und unkultivierten Sputumproben von 11 pwCF durchgeführt, um die Fähigkeit dieses Mediums zu überprüfen, das Wachstum von kommensalen und pathogenen Mikroben zu unterstützen, die häufig in Mukoviszidose-Sputum vorkommen. Wachstumskurven wurden aus 112 Isolaten von pwCF erhalten, um die Fähigkeit dieses künstlichen Sputummediums zur Unterstützung des Wachstums häufiger Mukoviszidose-Erreger zu überprüfen. Wir stellen fest, dass dieses Modell eine Vielzahl von Krankheitserregern und Kommensalen im CF-Sputum kultivieren kann, eine Gemeinschaft wiederherstellt, die dem unkultivierten Sputum unter normoxischen Bedingungen sehr ähnlich ist, und verschiedene Kulturphänotypen unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen erzeugt. Dieser neue Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der unvorhergesehenen Wirkungen führen, die durch die Verwendung von Sauerstoff in pwCF auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene induziert werden.
Introduction
Mukoviszidose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, dicken Schleim aus der Lunge zu entfernen, was zu wiederholten Infektionen und fortschreitendem Rückgang der Lungenfunktion führt, was oft zu einer Lungentransplantation oder zum Tod führt. Das Atemwegsmikrobiom von Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) scheint die Krankheitsaktivität1zu verfolgen, wobei eine Verringerung der mikrobiellen Vielfalt mit unerwünschten Langzeitergebnissen verbunden ist2,3. In klinischen Studien mit pwCF wurde die ergänzende Sauerstofftherapie mit fortgeschrittenerenErkrankungen inVerbindung gebracht 4,5, obwohl traditionell die Verwendung der Sauerstofftherapie einfach als Marker für die Schwere der Erkrankung angesehen wurde6. Jüngste Studien aus einer klinischen Studie mit Patienten mit Atemversagen haben gezeigt, dass ein höherer Sauerstoffgehalt bei Patienten paradoxerweise mit einer Zunahme schwerer bakterieller Infektionen und einer höheren Mortalität verbunden ist7, was darauf hindeutet, dass zusätzlicher Sauerstoff zur Pathogenese der Krankheit beitragen kann. Die Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Lungenmikrobiom und die damit verbundenen mikrobiellen Lungen- und Atemwegsgemeinschaften wurde nicht gut untersucht.
Mechanistische Studien können aufgrund logistischer Schwierigkeiten und potenzieller ethischer Probleme im Zusammenhang mit Interventionen mit unbekanntem medizinischem Nutzen oder Schaden oft nicht direkt am Menschen durchgeführt werden. Translationale Ansätze, die menschliche Bioproben in Modellsysteme integrieren, können in diesen Fällen wichtige biologische Erkenntnisse liefern. Während die Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, traditionell ein wichtiger Bestandteil der mikrobiellen Klassifizierung war, ist wenig darüber bekannt, wie die therapeutische Einführung von zusätzlichem Sauerstoff in die Umwelt mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege stören könnte. Um die unbekannten Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf die Atemwegsmikrobiome von pwCF zu beleuchten, mussten wir uns zwei großen Herausforderungen stellen; erstens die Schaffung eines Kulturmediums, das sich physiologisch der Zusammensetzung von CF-Sputum annähert; zweitens die Schaffung eines Modellsystems, das die Aufrechterhaltung erhöhter Sauerstoffkonzentrationen in Kultur über längere Zeiträume ermöglicht.
Künstliche Sputummedien (ASM) werden häufig verwendet, um Lungenputum ex vivo8,9,10zu emulieren , aber es gibt keinen klaren Konsens über ein bestimmtes Rezept. Dieses Protokoll beschreibt eine künstliche Sputum-Medium-Rezeptur und Zubereitungsstrategie, die sorgfältig entwickelt wurde, um Sputum von pwCF physiologisch anzunähern. Tabelle 1 zeigt die ausgewählten Rezeptwerte basierend auf veröffentlichter Literatur. Grundlegende chemische Komponenten und pH-Wert wurden mit Werten abgeglichen, die durch Studien an menschlichem CF-Sputum11,12,13 identifiziertwurden. Niedrige Konzentration physiologische Nährstoffe wurden unter Verwendung von Eigelb, das als 0,25% des Endvolumens10enthalten war, sowie Vitamin- und Spurenmetallmischungen14,15hinzugefügt. Mucin, die Schlüsselkomponente von Sputum16,wurde mit 1% w/v14eingeschlossen. Obwohl arbeitsintensiver, wurde die Filtersterilisation der konventionelleren Praxis der Wärmesterilisation vorgezogen, um potenzielle Probleme durch hitzeinduzierte Denaturierung wesentlicher Medienkomponenten zu reduzieren10. Ein zusätzlicher Vorteil der Filtersterilisation besteht darin, dass transparente Medien erzeugt werden (Die Wärmesterilisation kann aufgrund der Ausfällung und Koagulation von Salzen und Proteinen trübe Medien erzeugen), so dass diese künstlichen Auswurfmedien verwendet werden können, um das mikrobielle Wachstum auf der Grundlage einer Erhöhung der Trübung zu verfolgen.
Dieses Modellsystem für die hyperoxische Kultur basiert auf anaeroben Kultivierungstechniken, bei denen Sauerstoff hinzugefügt und nicht entfernt wird, wodurch ein Modell für die Wirkung der zusätzlichen Sauerstoffnutzung für pwCF erstellt wird. Abbildung 1 und das zugehörige Sauerstoffsparging-Protokoll skizziert die Komponenten eines Sauerstoff-Sparging-Systems, das kostengünstig von allgemeinen Labor- und Krankenhauslieferanten bezogen werden kann. Dieses System ermöglicht das Mischen von komprimiertem Sauerstoff und Luft zu festen Konzentrationen im Bereich von 21% -100% Sauerstoff. Die Integration eines Sauerstoffsensors ermöglicht die Überprüfung der Konzentration des Ausgangsgasgemisches sowie die Überprüfung der Ausflussgaszusammensetzung von zuvor verschonten Serumflaschen, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffbedingungen im gewünschten Bereich eingehalten wurden.
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Erzeugung eines künstlichen Sputummediums, den Aufbau und die Verwendung eines Sauerstoffsparsystems und die Anwendung beider auf DIE Kultur von CF-Sputum unter differentiellen Sauerstoffbedingungen.
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Protocol
Diese Studie wurde vom Partners Institutional Review Board genehmigt (Protokoll Nr. 2018P002934). Einschlusskriterium umfasste erwachsene Patienten mit Mukoviszidose, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung für die Studie erteilten. Es gab kein Ausschlusskriterium. Gemäß den Protokollrichtlinien wurden alle Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose während eines geplanten ambulanten Besuchs bei ihrem klinischen Anbieter gesammelt.
1. Künstliche Sputum Medium Vorbereitung
HINWEIS: Die hier aufgeführten Mengen beziehen sich auf die Herstellung von 1 l des endgültigen künstlichen Sputummediums und setzen die spezifischen Reagenzien voraus, die in der Materialtabelleaufgeführt sind. Die Nummern müssen für andere Mengen oder für die Verwendung verschiedener Reagenzien angepasst werden, um das gleiche Endprodukt zu gewährleisten. Für die Zielkonzentrationen siehe Tabelle 1.
- Künstlicher Sputum chemische Mischung (ASCM)
HINWEIS: ASCM macht 25% des endgültigen mittleren Volumens aus. Es ist lagerstabil und kann in großen Mengen oder im Voraus zubereitet werden. Wenn Sie für die spätere Verwendung vorbereitet sind, autoklavieren Sie die chemische Mischung und lagern Sie sie sicher bei Raumtemperatur.- Mischen Sie die konstituierenden chemischen Stammlösungen.
- Bereiten Sie 1 M NaCl-Brühe vor: Fügen Sie 58,44 g NaCl pro Liter steriles Wasser hinzu.
- 1 M KCl-Brühe zubereiten: 74,55 g KCl pro Liter steriles Wasser zugeben.
- 1 M MgSO4-Brühe vorbereiten: 246,47 g MgSO4·7H2O pro Liter steriles Wasser oder 120,37 g wasserfreies MgSO4 pro Liter steriles Wasser zugeben.
- Bereiten Sie 1 M Glukosevorrat vor: Fügen Sie 180,16 g Glukose pro Liter steriles Wasser hinzu.
- Autoklav sterilisieren Sie die chemischen Stammlösungen sowie eine leere 250-ml-Flasche. Führen Sie die Autoklavierschritte auf mindestens Standardwerte von 121 °C und 15 PSI für 30 min durch.
- Geben Sie 80,59 ml steriles Wasser in die leere 250 ml Flasche.
- Geben Sie 152,30 ml 1 M NaCl-Brühe in die Mischung.
- Geben Sie 15,8 ml 1 M KCl-Material zu der Mischung hinzu.
- 610 μL 1 M MgSO4-Brühe in die Mischung geben.
- Geben Sie 700 μL 1 M Glukosebrühe in die Mischung.
- Mischen Sie die konstituierenden chemischen Stammlösungen.
- Künstlicher Sputum Mucin Mix (ASMM)
HINWEIS: ASMM macht 50% des endgültigen mittleren Volumens aus. Stellen Sie sicher, dass es am selben Tag wie die endgültige mittlere Charge zubereitet wird.- 450 ml steriles Wasser in eine leere 1 L Flasche geben.
- 50 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Flasche geben.
- Fügen Sie der Flasche einen magnetischen Einwegrührbalken hinzu.
- Autoklavieren Sie die PBS-haltige Flasche und den Rührstab.
- Messen Sie 10 g Mucinpulver ab und geben Sie es dem PBS hinzu.
- Schütteln Sie die Flasche für das vorläufige Mischen kräftig.
- Stellen Sie die Flasche mit einem Magnetrührer auf eine Kochplatte. Stellen Sie die Hitze auf mittelhoch und zielt auf 50 ° C und die Rührgeschwindigkeit auf 1100 U / min. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit schrittweise, damit die Stange nicht vom Magneten abfliegt.
- 15 min erhitzen und umrühren lassen.
- Heben Sie die Flasche mit hitzebeständigen Handschuhen auf. Beobachten Sie, ob sich Mucinpulver aus der Lösung absetzt.
- Wenn Mucinpulver nicht vollständig gelöst ist, bringen Sie die Flasche für 5-minütige Intervalle zum Erhitzen / Rühren zurück, bis sie vollständig gelöst ist.
- Lassen Sie die Mucinmischung auf Raumtemperatur abkühlen.
- Biologische Mischung aus künstlichem Sputum (ASBM)
HINWEIS: ASBM beträgt 25% des endgültigen mittleren Volumens. Bereiten Sie es am selben Tag wie die endgültige mittlere Charge vor und setzen Sie seine Komponenten im Gegensatz zu den anderen Mischungen keiner Hitze aus.- Tauen Sie die 100-fache Vitaminbrühe in einem 4 °C Kühlschrank oder auf Eis auf.
HINWEIS: Portionieren Sie den Vitaminvorrat in 10 ml Aliquots vor, um die Anzahl der Gefrier- / Auftauzyklen zu minimieren. - Geben Sie 124,24 ml steriles Wasser in die leere autoklavierte 250 ml Flasche.
- Fügen Sie 25,76 ml 50x essentiellen Aminosäuren zu der Mischung hinzu.
- Fügen Sie 80,14 ml 100x nicht-essentiellen Aminosäuren in die Mischung hinzu.
- Fügen Sie 10 ml (aufgetauten) 100x Vitaminbrühe zu der Mischung hinzu.
- Fügen Sie 1 ml 1000x Spurenmetallmaterial zu der Mischung hinzu.
- Fügen Sie 8,33 ml 30% Eigelb-Emulsion zur Mischung hinzu.
- 400 μL 10 g/L Ferritin-Brühe in die Mischung geben.
- Mischen Sie die Lösung gut durch manuelles Schütteln.
- Tauen Sie die 100-fache Vitaminbrühe in einem 4 °C Kühlschrank oder auf Eis auf.
- Künstliches Sputummedium (ASM)
- Geben Sie 250 ml ASCM in die 1 L Flasche, die ASMM enthält.
- Geben Sie 250 ml ASBM in die mittlere Flasche.
- Titrieren Sie das Medium mit einem grundlegenden MOPS-Puffer (1 M), um einen pH-Wert von 6,3 auf einem pH-Papier im engen Bereich zu erreichen. Vor der Titration ist die Mediummischung zu sauer.
- Kühlen Sie das resultierende künstliche Sputummedium bei 4 °C, bis es filtrationsbereit ist.
- Um den Filtrationsprozess zu starten, geben Sie 200 ml ungefiltertes künstliches Sputummedium in ein Vakuumfiltrationssystem mit einem 0,22 μm Porengrößenfilter.
- Schließen Sie das Filtersystem an die Vakuumpumpe an, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie sie auf 70 mbar und stellen Sie die Kammer dann auf einen Orbitalschüttler, der bei 90 U / min in einem Kalten Raum bei 4 ° C schüttelt.
- Ergänzen Sie das Medium mit zusätzlichen 150 ml, da eine nennenswerte Menge gefiltert wird. Es dauert 1-2 Tage, um 1 L Medium vollständig zu filtern.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit zusätzlichen Kammern, bis alle Medien gefiltert sind.
HINWEIS: Versuchen Sie, nicht mehr als 350 ml des Mediums durch denselben 0,22 μm-Filter zu filtern, da Mucin den Filter im Laufe der Zeit verstopft.
- Filtriertes künstliches Sputummedium bei 4 °C bis zur Gebrauchsfertigkeit kühlen. Verwenden Sie ASM innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
2. Sauerstoffschonung
- Einrichtung der Sparging-Station
HINWEIS: Dieses Protokoll sollte nur einmal vollständig durchgeführt werden müssen, danach kann das Setup bei Bedarf durch einfache Wartung aufrechterhalten werden. Siehe Abbildung 1 für einen visuellen Schaltplan des Sauerstoffsparsystems.- Besorgen und sichern Sie die Druckluft- und Sauerstofftanks ordnungsgemäß.
VORSICHT: Hoher Druck macht die Tanks extrem gefährlich, wenn sie falsch gehandhabt werden. Stellen Sie sicher, dass die Tanks vollständig abgedichtet und gesichert sind, dass beim Schließen des Tanks keine Lecks auftreten und dass das gesamte Umschlagpersonal vollständig in ihrer Verwendung geschult ist. - Befestigen Sie einen Luftregler mit einem Schraubenschlüssel am Drucklufttank. Für eine optimale Durchflussmessung am Regler befestigen Sie den Regler so nah wie möglich an einer aufrechten Position.
- Befestigen Sie einen Sauerstoffregler am komprimierten Sauerstofftank und befestigen Sie ihn so nah wie möglich an einer aufrechten Position. Abhängig von der Sauerstoffflasche muss man möglicherweise die Richtung zum Anziehen umkehren.
- Verbinden Sie den Schlauch von den Reglern mit einem Y-Stecker, um den Gasfluss aus den beiden Tanks zu kombinieren.
- Schließen Sie den Ausgang des Y-Steckers an das zentrale T-Sperrschichtventil an.
- Schließen Sie eine Seite des zentralen T-Sperrschichtventils an ein Gasmanometer an.
- Schließen Sie die andere Seite des Gasdruckmessgeräts an einen sterilen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Porengröße von 0,22 μm an.
- Befestigen Sie einen zweiten Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm an einer Spritze ohne Kolben, der während des Spargings als Gasfreisetzung verwendet werden kann.
- Schließen Sie die letzte Seite des zentralen T-Junction-Ventils an ein zweites T-Junction-Ventil für den Sauerstoffmonitor an.
- Schließen Sie einen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm an eine Seite dieses zweiten T-Junction-Ventils an, zusammen mit einem Schlauch, um 18 G-Nadeln anzubringen.
- Schließen Sie die letzte Seite des zweiten T-Sperrschichtventils an die Sauerstoffüberwachungsvorrichtung an.
- Schließen Sie ein Trennrohr an die andere Seite der Sauerstoffüberwachungsvorrichtung an, das während der Überwachung als Gasfreisetzung verwendet werden soll.
VORSICHT: Achten Sie beim Testen/Verwenden des Sauerstoffsparsystems sorgfältig auf die Position der T-Übergänge und stellen Sie sicher, dass sie mit dem beabsichtigten Weg durch das System übereinstimmt. Andernfalls kommt es zu einem Druckaufbau im System und dazu führt, dass Komponenten ausfallen und auseinanderfallen. - Für die Wartung des Systems und um es mit optimaler Leistung arbeiten zu lassen, sind die folgenden Praktiken von Vorteil.
- Verstärken Sie die Verbindungen mit großzügigen Mengen an Teflonband, um ihre Abdichtung erheblich zu verbessern und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Komponenten vom Innendruck getrennt werden.
- Halten Sie die kombinierte Durchflussrate unter 10 l /min, um den maximalen Druck zu verringern und Ausfälle zu vermeiden.
- Wenn ein Leck vermutet wird, verwenden Sie eine Reinigungsmittellösung wie handelsübliche Flüssigkeitslecksuchgeräte, um seinen Standort leicht zu identifizieren, da er über Gaslecks sprudelt. Patchlecks mit einem Polytetrafluorethylen-Tape (z. B. Teflon).
- Ersetzen Sie die Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm im Sauerstoffsparsystem alle zwei Wochen, dies variiert jedoch mit der Häufigkeit der Anwendung. Im Laufe der Zeit reduzieren Partikel, die sich im Filter verfangen, die Gasdurchflussrate und verursachen Druckaufbau.
- Kalibrieren Sie den Sauerstoffmonitor vor der Durchführung von Messungen auf 21% Sauerstoffdruckluft.
- Schalten Sie nach Abschluss des Systemeinsatzes die Tanks aus und entlüften Sie das überschüssige Gas aus den Reglern, bis der Durchfluss vollständig stoppt.
- Besorgen und sichern Sie die Druckluft- und Sauerstofftanks ordnungsgemäß.
- Serumflaschenkultur schonend
- Etikettieren Sie 500 ml autoklavierte Serumflaschen mit Probenidentifikatoren, Datum/Uhrzeit der Impfung und Zielsauerstoffanteil.
- Geben Sie in einer biologischen Haube 24 ml des künstlichen Sputummediums zu jeder aufzustellenden Serumflasche hinzu.
- Geben Sie 1 ml des Mit einer 18-G-Nadel homogenisierten Auswurfs des Patienten (gegebenenfalls mit steriler Kochsalzlösung verdünnt, um für jede Kulturbedingung ein ausreichendes Probenvolumen zu erhalten) in jede Serumflasche.
- Legen Sie die autoklavierten Gummistopfen mit einer sterilen Pinzette auf die Oberseite jeder Serumflasche.
- Drücken Sie die Gummistopfen nach unten, achten Sie darauf, die Unterseite des Stopfens nicht mit den Händen zu berühren.
- Entfernen Sie die Flaschen von der Haube, tragen Sie die Aluminiumdichtungen auf und crimpen Sie sie. Entfernen Sie das Mittelstück von den Dichtungen.
- Wischen Sie die Oberseite der Flaschen mit einem Alkoholtuch ab und führen Sie sie durch eine Bunsenbrennerflamme.
- Befestigen Sie eine sterile 18-G-Nadel mit einem Filter auf einer taucherlosen Spritze. Setzen Sie diese Gasfreisetzung zuerst in die Flasche ein.
- Befestigen Sie eine sterile 18-G-Nadel am Gasausgang des Systems und führen Sie die Gasausgangsnadel ebenfalls in die Flasche ein.
- Leiten Sie die T-Kreuzungen von den Tanks durch den Sauerstoffmonitor. Stellen Sie sicher, dass die Zielsauerstoffkonzentration durch das System fließt. Ziel ist ein Gasdurchfluss von ca. 5 l/min.
- Leiten Sie die T-Übergänge von den Tanks bis zum Gasausgang um. Das Gas beginnt durch die Serumflasche zu fließen.
VORSICHT: Achten Sie beim Sauerstoffsparen genau auf das Manometer. Wenn der Druck unerwartet ansteigt, schalten Sie das System sofort aus. - 1 Min. Sauerstoff durch die Serumflasche laufen lassen. Bei 5 L/min ermöglicht dies 10 Luftwechsel und sorgt dafür, dass die Innenatmosphäre den gewünschten Partialdruck erreicht.
- Entfernen Sie die 18-G-Nadel mit Gasfreisetzung.
- Lassen Sie den Druck in der Serumflasche auf +1 Atmosphäre (2 Atmosphären auf Meereshöhe) aufbauen und entfernen Sie dann sofort die Gasausgangsnadel.
HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des Drucks unterstützt die Beibehaltung hyperoxischer Bedingungen im Laufe der Zeit. - Legen Sie die Serumflasche bei 150 U/min in einen 37 °C Inkubator-Shaker. Inkubieren Sie die Proben für drei 24-Stunden-Intervalle. Nehmen Sie in jedem 24-Stunden-Intervall ein Aliquot für die nachgeschaltete Analyse, schonen Sie die Proben erneut und bringen Sie sie für eine Gesamtinkubationszeit von 72 h zur Inkubation zurück.
- Abflusssauerstoffmessung
- Kalibrieren Sie das Sauerstoffmessgerät auf 21% Druckluft und schalten Sie dann den Tank aus.
- Führen Sie die Serumflaschenaufnahme durch den Sauerstoffmonitor und befestigen Sie eine sterile Nadel am Ende.
- Führen Sie die Nadel durch den Gummistopfen in die Serumflasche ein.
- Warten Sie, bis sich der Abflusswert stabilisiert hat. Eine geringe Durchflussrate aus den Serumflaschen bedeutet, dass dies bis zu 2 Minuten dauern kann. Geben Sie die Spitzendifferenz zur Raumluft an (Zahl am weitesten von 21%).
- Wenn Sie mehrere Messwerte durchführen, spülen Sie das System zwischen den Messwerten mit Druckluft.
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Representative Results
Diese Protokolle wurden auf 50 expektorierte Sputumproben von pwCF angewendet, die einer ambulanten Mukoviszidose-Klinik am Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts, zur Routineversorgung vorgelegt wurden. Das Sputum jedes Patienten wurde unter 21%, 50% und 100% Sauerstoffbedingungen unter Verwendung des künstlichen Sputummediums kultiviert, wobei 0,5 ml Aliquots aus jeder Kultur nach 24 h, 48 h und 72 h Kulturzeit zum Testen entnommen wurden. Kulturen wurden fotografiert, als Extraktionen vorgenommen wurden, um visuelle Veränderungen zu verfolgen. Zusätzlich wurde vor der Kultivierung von jeder primären Sputumprobe ein Aliquot von 0,5 ml entnommen. Dies führte zu 10 diskreten Proben pro Patient und einem letzten N von 500 Proben. Von diesen wurde Sputum von 11 Patienten (11 unkultivierte Sputa, 11 kultivierte Sputa aus 21% Sauerstoff bei 48 h Inkubation) einer Nukleinsäureextraktionunterzogen 17, Sequenzierungsbibliotheken wurden mit einem kommerziellen DNA-Bibliotheksvorbereitungskit generiert, und metagenomische Sequenzierung wurde auf einer gesamten Genomsequenzierungsplattform durchgeführt, die auf ~ 5 GB Sequenz pro Probe mit 150 Basenpaaren abzielte. paired-end liest. Raw-Reads wurden mit der bioBakery-Suite von Tools18verarbeitet, die Qualitätskontrolle und Entfernung menschlicher "Kontaminanten" -Sequenzen sowie taxonomische Profilerstellung mit dem MetaPhlAn3-Profiler19umfasst. Zum Zeitpunkt der Nukleinsäureextraktion wurden 10 Millionen Zellen von Imtechella halotolerans,einer halotoleranten Spezies, die normalerweise in Mündungsökosystemen und nicht in menschlichen mikrobiellen Gemeinschaften vorkommt, in jede Probe gespießt, was die Quantifizierung der absoluten mikrobiellen Belastung für jede Probe ermöglicht20.
Abbildung 2 zeigt individuelle und durchschnittliche Abfluss-Sauerstoffmessungen und pH-Werte im Verlauf des Kulturprozesses für 50 Sputumproben, die unter jeder Sauerstoffbedingung kultiviert wurden, und ein Beispiel für einen visuellen differentiellen Kulturphänotyp. Die Kulturen wurden bei 37 °C gehalten, außer in kurzen Zeiträumen, in denen das Sparging und die Entfernung von Probenaliquots durchgeführt wurden. Bei beiden Sparging-Intervallen von 12 h und 24 h wurden erhöhte Sauerstoffkonzentrationen beibehalten, obwohl für alle drei Sauerstoffbedingungen ein Abfall im Laufe der Zeit beobachtet wurde, wobei 100% Sauerstoff auf etwa 85%, 50% Sauerstoff auf 40% und 21% Sauerstoff auf 18% fielen. Die Sauerstoffbedingungen blieben unterschiedlich, und vor allem wurden während des gesamten Prozesses erhöhte Sauerstoffkonzentrationen für hyperoxische Proben aufrechterhalten. pH-Messungen zeigten einen höheren Grad an Variabilität, blieben aber innerhalb eines physiologisch normalen Bereichs ohne statistisch signifikante Veränderungen im Laufe der Zeit. Diese Messungen deuten darauf hin, dass diese Methoden diskrete differentielle Sauerstoffbedingungen während des gesamten Kulturprozesses aufrechterhalten. Schließlich wird ein Beispiel für einen von vielen visuellen Kulturphänotypen gezeigt, die sich über die Sauerstoffkonzentration unterscheiden. Diese Probe hatte nach 72 h Kultur deutliche Trübungsunterschiede, wobei höherer Sauerstoff mit einer geringeren visuellen Trübung verbunden war. Differentielle Kulturphänotypen unterstützen das Vorhandensein von Hyperoxie-induzierten Effekten auf Kulturgemeinschaften.
Abbildung 3 vergleicht die mikrobielle Belastung, die mikrobielle Vielfalt und die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen unkultiviertem Sputum und kultiviertem Sputum (21% Sauerstoffzustand für einen Zeitraum von 48 h). Messungen zeigen, dass der einzige große Unterschied, der durch den Akt der Kultivierung eingeführt wird, eine etwa 20-fache Erhöhung der mikrobiellen Belastung im Vergleich zu unkultiviertem Sputum ist. Das Immunsystem und die typischen mechanischen Sputum-Clearance-Mechanismen wie Husten dienen normalerweise als Regulationsprozess, der die mikrobielle Belastung in der Lunge begrenzt, selbst bei Funktionsstörungen und Infektionen wie bei pwCF. Ex-vivo-Kultur hat keine solchen Regulationsmechanismen, und mikrobielle Gemeinschaften sind stattdessen frei, in Richtung Zellsättigung zu gehen. Alpha- und Beta-Diversitätsmetriken zeigen, dass trotz dieses Unterschieds in der mikrobiellen Belastung die zugrunde liegende Zusammensetzung der Gemeinschaft gut erhalten bleibt, mit minimalen globalen Unterschieden, die durch den Kulturprozess eingeführt werden.
Abbildung 4 erweitert den Vergleich zwischen unkultivierten und kultivierten Sputumproben und betrachtet die binäre Anwesenheit/Abwesenheit der 120 mikrobiellen Spezies, die durch Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung aus kultiviertem und unkultiviertem Sputum von 11 Patienten schlüssig identifiziert wurden. Mikroben sind basierend auf phylogenetischen Ähnlichkeiten gruppiert. 46 (38,3%) dieser Arten wurden sowohl in unkultivierten als auch in kultivierten Proben (Cyanfarbe) identifiziert, während 35 (29,2%) ausschließlich in unkultivierten Proben (gelb) und 39 (32,5%) ausschließlich in kultivierten Proben (blau) identifiziert wurden. Es ist wahrscheinlich, dass es eine größere Parität gibt als das, was wir mithilfe der Sequenzierung in Bezug auf das, was vorhanden ist und was fehlt, identifiziert haben, aber einige Taxa fallen in einigen Fällen unter die Sequenzierungserkennungsschwelle. Die Unterschiede deuten darauf hin, dass der Kulturprozess eine gewisse Verzerrung im kultivierten im Vergleich zu unkultiviertem Sputum einführt. Vor allem erhöht die Kultivierung das Vorhandensein von Pilzen wie Candida und Aspergillussowie Enterobacterales-Mitgliedern, einschließlich Escherichia-, Serratia-und Streptococcus-Mitgliedern. Umgekehrt waren Bacteroidetes-Mitglieder wie Prevotella und Clostridiales, die Anaerobier sind, in unkultivierten Proben vorhanden, aber nicht in kultivierten Proben. Dies kann auf das Fehlen einer anaeroben Erkrankung in unserem experimentellen Modell zurückgeführt werden.
Abbildung 5 zeigt absorptionsbasierte Wachstumskurven von häufigen CF-Lungenerregern, die aus Sputum isoliert wurden, das aus 50 verschiedenen pwCF gewonnen wurde. Diese Isolate stellen phänotypisch unterschiedliche klinische Isolate dar, die unter Verwendung von Anreicherungskulturverfahren des Massachusetts General Hospital Clinical Microbiology Laboratory erhalten wurden, und umfassen Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) und Achromobacter sp (N = 7). Wachstumskurven wurden erhalten, indem jedes Isolat in künstlichen Sputummedien bei 37 °C im Dunkeln kultiviert wurde, wobei ASM ohne bakterielle Impfung als Negativkontrolle diente. Die transparente Qualität von ASM (die eher auf Filter als auf Wärmesterilisation zurückzuführen ist) ermöglicht die Durchführung optischer Messungen zur Abschätzung von Wachstumskurven. Optische Messwerte bei 600 nm (OD600) wurden alle 10 Minuten gemessen, und die ersten 24 Stunden jeder Kurve werden angezeigt. Das Fehlen von Änderungen der optischen Messwerte in der ASM-only-Negativkontrolle weist auf kontaminationsfreie Kulturen hin. Die hier gezeigten anschaulichen Kurven folgen typischen Wachstumskurvenmustern, die die Realisierbarkeit dieses ASM-Rezepts als Medium für die absorbanzabasierte Erzeugung von Wachstumskurven anzeigen.
| Spalte 1 | Spalte 2 | Spalte 3 | Spalte 4 | Spalte 5 | Spalte 6 | Spalte 7 | Spalte 8 | Spalte 9 | |
| Wert | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Quelle | |
| Muzin | 2% ohne Mw. | 0,5% w/v | 0,5% w/v | - | 1% mit/ mw | 2% ohne Mw. | 1% mit/ mw | Flynn | |
| Natriumchlorid | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre | |
| Kaliumchlorid | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Magnesiumsulfat | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0,61 mM | Palmer | |
| Eisensulfat | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Ammoniumchlorid | - | - | - | 2,3 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Monokaliumphosphat | - | - | - | 2,5 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Traubenzucker | - | - | - | 3,2 mM | 13 mM | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Lactat | - | - | - | 9 m² | - | - | - | - | |
| Essentielle Aminosäuren | 14,45-fach | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Pro Säure | 0,5-fach | 0,375-fach | 1,29-fach | Palmer | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | 28,9-fach | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Pro Säure | 0,25-fach | 0,5-fach | 8,01-fach | Palmer | |
| Vitamine | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Spurenmetalle | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Eigelb | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritin | 0,0003 g/L | - | - | - | - | 0,0004 g/L | 0,0004 g/L | Gallagher | |
| Lachs Spermien DNA | 1,4 g/L | 4 g/l | 4 g/l | - | - | 1,4 g/L | - | - | |
| DPTA | - | - | 0,0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| Ph | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Lagerung | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Sterilisation | Autoklav | Filter | Autoklav | - | Autoklav | Autoklav | Filter | Kirchner | |
Tabelle 1: Rezept für künstliches Sputummedium aus Literaturübersicht. (Spalte 1) Reagenzien und Schlüsselwerte bei der Formulierung von künstlichem Sputummedium. (Spalten 2-7) Vergleich von Rezepten aus der vorhandenen Literatur8,9,10,12,14,15. (Spalten 8-9) Künstliches Sputum-Medium-Rezept, das in diesem Protokoll und den entsprechenden Quellen beschrieben ist, die jeden ausgewählten Wert10,11,12,13,14,15informiert haben.
| Spalte 1 | Spalte 2 | Spalte 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Aminosäuren gesamt | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanin | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginin | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Asparagin | 0,91 mM | |
| Asparaginsäure | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cystein | 0,09 mM | 0,33 mM |
| Glutaminsäure | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glycin | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidin | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucin | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucin | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lysin | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Methionin | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornithin | 0,36 mM | |
| Phenylalanin | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Prolin | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serin | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Threonin | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Tryptophan | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tyrosin | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valin | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabelle 2: Aminosäurekonzentrationen, die zuvor in Mukoviszidose-Sputum und in künstlichen Sputum-Medium-Rezepten beschrieben wurden, die in diesem Protokoll beschrieben sind. (Spalte 1) Wichtige Aminosäuren. (Spalte 2) Aminosäurekonzentrationen von Sputum von Menschen mit Mukoviszidose12. (Spalte 3) Aminosäurekonzentrationen in künstlichem Sputummedium, die in diesem Protokoll beschrieben sind
Abbildung 1: Anschlussschema der komponenten des sauerstoffsparenden Systems. Flussdiagramm der Verbindungen zwischen den Komponenten des Systems, das verwendet wird, um Serumflaschen auf gewünschte Sauerstoffkonzentrationen zwischen 21% und 100% zu reduzieren. Das System verfügt über 3 Nutzungsmodi, die durch die Position der beiden T-Junction-Ventile bestimmt werden. Das System kann Gas aus den Tanks durch den Gasausgang oder durch den Sauerstoffprozentmonitor leiten sowie Ausflussgas aus zuvor geschonten Serumflaschen durch den Monitor leiten, um die Konzentration nach Ablauf der Zeit zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Zielsauerstoffkonzentrationen werden sowohl mit 12 h- als auch mit 24 h-Sparging-Intervallen ungefähr aufrechterhalten, und der pH-Wert bleibt während der Kultur im physiologischen Bereich. (A) Ausfluss-Sauerstoff-Messwerte von 12 h und 24 h Sauerstoff-Sparging-Intervalle über einen Zeitraum von 72 h. (B) pH-Messwerte für Proben, die alle 24 h gemessen werden. (C) Ein Beispielbild der kultivierten Probe CFB010 nach 72 h, das die differentielle Trübung über die Sauerstoffkonzentrationen zeigt. Die Farbe gibt den Zielsauerstoffanteil an; Fehlerindikatoren bezeichnen 95 %-Konfidenzintervalle. Kritische Schwellenwerte werden mit gestrichelten Linien hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Die Kultivierung erhöht die mikrobielle Belastung, aber die zugrunde liegende Zusammensetzung der Gemeinschaft bleibt erhalten. Unkultiviertes Sputum (gelb) und kultiviertes Sputum (blau) mit künstlichem Sputummedium bei 21% Sauerstoff für 48 h. Aliquots wurden einer Nukleinsäureextraktion und einer Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung unterzogen, um mögliche Verzerrungen durch Kulturbedingungen zu erkennen. (A) Absolute mikrobielle Belastung (bestimmt durch Spike-in-Kontrollen) und Alpha-Diversity-Metriken. Unter Verwendung linearer Mixed-Effects-Modelle sagte unkultiviertes vs. kultiviertes Sputum die mikrobielle Belastung voraus, aber keine Alpha-Diversität. (B) Ordination der ersten beiden Komponenten der Beta-Diversitätsmetriken unter Kontrolle der Differenz in der mikrobiellen Belastung. Kein signifikanter Unterschied in beiden Metriken nach PERMANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Mehrheit der identifizierten Taxa ist sowohl im Quellputum als auch in der Kultur vorhanden, während andere nur im Quellsputum oder in der Kultur vorkommen. Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung, die verwendet wird, um Unterschiede in der Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften zwischen unkultivierten und kultivierten Sputumproben zu vergleichen. Phylogenetischer Stammbaum aller identifizierten mikrobiellen Arten in sequenzierten Proben (N = 120). Gelb markierte Arten (N = 35, 29,2%) wurden nur in unkultivierten Sputumproben gesehen. Mit Blau markierte Arten (N = 39, 32,5%) wurden nur in künstlichen Sputum-Medium-Kulturproben gesehen. Mit Cyan markierte Arten (N = 46, 38,3%) wurden sowohl in unkultivierten als auch in kultivierten Proben beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Künstliches Sputummedium ist ausreichend transparent, um als Wachstumskurvenmedium für die Kultivierung klinischer Isolate verwendet zu werden. Optimale Dichtemessungen bei 600 nm wurden alle 10 Minuten gemessen, und die ersten 24 Stunden jeder Kurve werden angezeigt. Graue Linien stellen einzelne Messwerte dar, und orange Linien stellen die mittlere Absorption für jedes Taxon dar. Künstlicher Sputum mittlerer Rohling als Kontrolle enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Lungengemeinschaften zu untersuchen. Dieses Modell, das auf künstlichem Sputummedium und täglichem Sparging von Serumflaschen basiert, hält erhöhte Sauerstoffkonzentrationen aufrecht und unterstützt das Wachstum von Mikroben, die im Sputum von pwCF identifiziert wurden.
Es gibt mehrere kritische Schritte dieses Ansatzes. Erstens ist die Wahl, Filter-Sterilisation anstelle von Hitze-Sterilisation des künstlichen Sputum-Mediums zu verwenden. Die Filtersterilisation verhindert die Denaturierung von Mucin und anderen wärmeempfindlichen Bestandteilen des Mediums und ergibt ein klares Medium, das für optische Messungen des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Während die Filtersterilisation in anderen Protokollen10vorgeschlagen wurde, haben wir festgestellt, dass die Zugabe von Orbitalschütteln während des Filtrationsprozesses wesentlich war, um eine Verstopfung des Filters zu verhindern, die sonst auftrat, wenn eine minimale Menge des vorbereiteten Mediums gefiltert worden war. Während das gefilterte künstliche Sputummedium aufgrund der Mucinimpaktion im Filter eine niedrigere als die beabsichtigte endgültige Mucinkonzentration aufweisen kann, wurde gezeigt, dass Sputum von pwCF niedrigere Mucinkonzentrationen aufweist als Sputum von Menschen ohne Mukoviszidose21. Die in diesem Protokoll verwendete Ausgangsmucinkonzentration von 1% ist höher als bei anderen Ansätzen, die eine Filtersterilisation verwendet haben, wobei eine Gruppe eine Ausgangsmucinkonzentration von 0,5%10verwendet, während typische Rezepte Mucinkonzentrationen im Bereich von 0,5% -2% verwenden (Tabelle 1). Selbst bei einem Verlust von Mucin im Filter-Sterilisationsprozess weist das unter Verwendung dieses Protokolls hergestellte Endmedium wahrscheinlich Mucinkonzentrationen im physiologischen Bereich auf22.
Die zweite ist die Zusammensetzung des künstlichen Sputummediums. Die Rezeptur für künstliches Sputummedium wurde auf der Grundlage bestehender physiologischer Studien von Sputum aus pwCF ausgewählt (Tabelle 1). Mit Hilfe der Shotgun-Metagenomik-Sequenzierung konnten wir überprüfen, dass Sputum, das mit diesem künstlichen Sputummedium kultiviert wurde, die mikrobielle Gemeinschaftszusammensetzung von unkultiviertem Sputum weitgehend rekapituliert (Abbildung 3). Unter normoxischen Bedingungen unterstützte dieses Medium auch das Wachstum von 112 verschiedenen klinischen Isolaten, die häufige Krankheitserreger darstellen, die aus dem Sputum von Mukoviszidose-Patienten isoliert wurden. Somit zeigen diese Daten, dass diese Formulierung von künstlichem Sputummedium das Wachstum der Atemwegsmikrobiota von pwCF unterstützt. Lachssperma-DNA, eine häufige Ergänzung zu bestehenden Rezepten (Tabelle 1), wurde weggelassen. Eine beabsichtigte Anwendung dieses Modells ist die Metagenomik-Sequenzierung, und daher wurde die Lachssperma-DNA nicht eingeschlossen, um die Zugabe von nicht-mikrobiellen Nukleinsäuren zu reduzieren, da diese Nachlesewerte nach der Sequenzierung herausgefiltert würden, wodurch unsere effektive Sequenzierungstiefe verringert würde. Während Sputum aus pwCF hohe Konzentrationen an extrazellulärer DNA23aufweist, ist ein signifikanter Anteil davon mikrobiellen Ursprungs24, und es ist unklar, ob die Zugabe von Lachssperma-DNA zum künstlichen Sputummedium es physiologischer macht oder ob der in diesem Protokoll beschriebene Kulturansatz zu hohen Konzentrationen mikrobiell abgeleiteter extrazellulärer DNA führt; Wir haben in unseren Studien nicht zwischen extra- und intrazellulären DNA-Konzentrationen unterschieden. Zukünftige Studien könnten die Konzentration von extrazellulärer DNA überprüfen, die durch diese Kultivierungsmethode erzeugt wird.
Drittens haben unseres Wissens keine veröffentlichten Studien über mukoviszidose lunge mikrobielle Gemeinschaften hyperoxische Zustände behandelt. Dieses Modell verwendet kostengünstige und allgemein verfügbare Geräte von allgemeinen Labor- oder Krankenhauslieferanten, um ein Sauerstoffsparsystem zu bauen. Wichtige Überlegungen für die Aufrechterhaltung hyperoxischer Bedingungen sind das Volumen des Kulturmediums im Verhältnis zum verfügbaren Kopfraum in den Serumflaschen. Bei ersten Versuchen während der Protokollentwicklung wurden 125 ml Serumflaschen verwendet. Die Verwendung von 500-ml-Serumflaschen (unter Berücksichtigung eines 475-ml-Kopfraums zu einem Kulturverhältnis von 25 ml) ermöglichte jedoch die Aufrechterhaltung der gewünschten Konzentration für bis zu 24 h, wodurch die Häufigkeit der Sauerstoffverringerung verringert wurde. Dieser Ansatz erzeugt diskrete Sauerstoffbedingungen und ermöglicht so die gleichzeitige Kultur verschiedener Patientenproben über mehrere Sauerstoffbedingungen hinweg. Andere Werkzeuge aus der anaeroben Kultur können für die hyperoxische Kultur genutzt werden, einschließlich der Verwendung von anaeroben Gläsern oder Balch-Röhrchen, die mit Sauerstoff versetzt sind. Analysen von mikrobiellen Lungengemeinschaften unter Verwendung der Metagenomik-Sequenzierung zeigen, dass die gesamte Alpha- und Beta-Diversität zwischen kultiviertem und unkultiviertem Sputum vergleichbar ist. Bei der Bewertung der differentiellen Häufigkeit auf Artenebene, Kultivierung bei 21% Sauerstoff, angereichert für das Wachstum von Aeroben und fakultativen Anaerobiern, einschließlich Enterobacterale, Streptococcus und Pilzen. Dies ist wahrscheinlich auf den Ausschluss eines anaeroben Zustands zurückzuführen, der in den Atemwegen von pwCF25,26beobachtet wurde. Zukünftige Studien könnten die Einbeziehung von Stickstoffgas in dieses Modell in Betracht ziehen, um eine Reihe von anoxischen und oxischen Bedingungen und entsprechende aerobe und anaerobe Mikrobiota zu untersuchen, die in mikrobiellen Gemeinschaften der Atemwege gefunden werden.
Die in diesen Protokollen beschriebenen Schlüsselprinzipien können für die Durchführung ähnlicher Studien im Zusammenhang mit dem Einfluss von Sauerstoff auf komplexe mikrobielle Gemeinschaften oder häufige Lungenpathogene aufschlussreich sein. Sauerstoff ist die am häufigsten verwendete Therapie bei der Behandlung aller fortgeschrittenen Lungenerkrankungen, und ein besseres Verständnis dafür, wie es zu kollateralen unvorhergesehenen Auswirkungen auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene führen kann, wird für die Behandlung von pwCF und anderen chronischen Lungenerkrankungen wichtig sein.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Ein Teil dieser Arbeit wurde im Marine Biological Lab mit Unterstützung des Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (Fördernummer 5600373) und einem Geschenk der Simons Foundation durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
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