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Biology

पार्किंसंस रोग के एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे मॉडल में एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया की रेटिंग

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया के कृंतक मॉडल एल-डोपा के बार-बार प्रशासन के कारण उभरने वाली अभिव्यक्तियों को कम करने या विकास को कम करने के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए अमूल्य उपकरण हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि पार्किंसंस रोग के एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे मॉडल में डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलनों को कैसे प्रेरित और विश्लेषण किया जाए।

Abstract

एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया (एलआईडी) मोटर जटिलताओं को संदर्भित करता है जो पार्किंसंस रोग (पीडी) वाले रोगियों को लंबे समय तक एल-डोपा प्रशासन से उत्पन्न होता है। क्लिनिक में देखा गया सबसे आम पैटर्न पीक-डोज डिस्केनेसिया है जिसमें कोरिफॉर्म, डिस्टोनिक और बैलिस्टिक आंदोलनों की नैदानिक अभिव्यक्तियां शामिल हैं। पीडी का 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए) चूहा मॉडल एलआईडी की कई विशेषताओं की नकल करता है। बार-बार एल-डोपा प्रशासन के बाद, 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलनों (जैसे, असामान्य अनैच्छिक आंदोलनों, एआईएम) का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि निग्रोस्ट्रियल मार्ग में 90% -95% डोपामिनर्जिक कमी के साथ 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों में एआईएम को कैसे प्रेरित और विश्लेषण किया जाए। एल-डोपा (5 मिलीग्राम / किग्रा, 12.5 मिलीग्राम / किग्रा बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त) के बार-बार प्रशासन (3 सप्ताह) एआईएम के विकास को प्रेरित कर सकते हैं। टाइम कोर्स विश्लेषण से 30-90 मिनट (पीक-डोज डिस्केनेसिया) पर एआईएम में महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चलता है। एलआईडी के कृंतक मॉडल प्रभावी एंटीडिस्किनेटिक हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रीक्लिनिकल उपकरण हैं।

Introduction

डोपामाइन अग्रदूत एल -3,4-डायहाइड्रॉक्सीफेनीलएलनिन (एल-डोपा) पार्किंसंस रोग (पीडी) 1 के मोटर लक्षणों के लिए सबसे प्रभावी उपचार का प्रतिनिधित्व करता है। एल-डोपा थेरेपी पीडी से जुड़े मोटर लक्षणों को सुधार सकती है लेकिन समय के साथ प्रभावशीलता खो देती है। मोटर उतार-चढ़ाव जैसे "पहनने-बंद उतार-चढ़ाव" या "खुराक के अंत में गिरावट" नैदानिक रूप से एकल एल-डोपा खुराक2 के प्रभाव की छोटी अवधि के रूप में प्रकट होते हैं। अन्य मामलों में, नैदानिक अभिव्यक्तियों में धीमी गति से घुमावदार आंदोलनों और असामान्य मुद्राओं (डिस्टोनिया) 3 शामिल होते हैं और तब होते हैं जब डोपामाइन का स्तर कम होता है (ऑफ-पीरियड डिस्टोनिया)4। दूसरी ओर, एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया (एलआईडी) तब दिखाई देते हैं जब प्लाज्मा और मस्तिष्क में डोपामाइन का स्तर अधिक होताहै।

एलआईडी दुर्बल करने वाले दुष्प्रभाव पैदा करते हैं जिनमें मोटर जटिलताएं जैसे कि कोरिफॉर्म, डिस्टोनिक और बैलिस्टिक6 आंदोलन शामिल हैं। एक बार स्थापित होने के बाद, एलआईडी प्रत्येक एल-डोपा प्रशासन के बाद होता है। 5 साल के लिए एल-डोपा थेरेपी से गुजरने वाले पीडी रोगियों के 40% -50% में मोटर जटिलताएं होती हैं, और 7 वर्षों में घटना बढ़ जातीहै। यद्यपि पीडी रोगियों में एलआईडी के विकास में शामिल पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हैं, डोपामिनर्जिक डीनेरवेशन, पल्सटाइल एल-डोपा प्रशासन, स्ट्रिएटल प्रोटीन और जीन में डाउनस्ट्रीम परिवर्तन, और गैर-डोपामाइन ट्रांसमीटर सिस्टम में असामान्यताएं ऐसे कारक हैं जो इन अवांछित दुष्प्रभावों के विकास में योगदान करते हैं 6,8,9,10।

न्यूरोटॉक्सिन 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए) कृन्तकों 11,12,13,14 में पीडी का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता वाला उपकरण है। चूंकि 6-ओएचडीए रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार नहीं करता है, इसलिए इसे सीधे निग्रोस्ट्रियल मार्ग में इंजेक्ट किया जाना चाहिए। 6-ओएचडीए-प्रेरित डोपामिनर्जिक कमी एकाग्रता- और साइट-निर्भर15 है। औसत दर्जे के फोरब्रेन बंडल (एमएफबी) पर 6-ओएचडीए का एकतरफा प्रशासन कृन्तकों में गंभीर (>90%) निग्रोस्ट्रियल क्षति पैदा कर सकता है। एल-डोपा का गंभीर एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले कृन्तकों को क्रोनिक प्रशासन असामान्य अनैच्छिक आंदोलनों (एआईएम) नामक डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलनों की उपस्थिति का कारण बनता है। कृन्तकों में डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलन पीडी रोगियों में एलआईडी से संबंधित समान आणविक, कार्यात्मक और औषधीय तंत्र साझा करतेहैं। इसलिए, 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे20 और चूहे21 एलआईडी का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान प्रीक्लिनिकल मॉडल हैं। जब एल-डीओपीए (5-20 मिलीग्राम / किग्रा) की चिकित्सीय खुराक के साथ क्रोनिक रूप से (7-21 दिन) इलाज किया जाता है, तो एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों और चूहों में एआईएम का क्रमिक विकास होता है जो घाव के विपरीत अग्रभाग, ट्रंक और ओरोफेशियल मांसपेशियों को प्रभावित करते हैं 17,18,19,20,22,23,24 . इन आंदोलनों को पीडी रोगियों25 में एल-डोपा-प्रेरित पीक-डोज डिस्केनेसिया के समान एक समय पाठ्यक्रम में प्रस्तुत किया जाता है और हाइपरकाइनेटिक आंदोलनों और डिस्टोनिया 5 की विशेषता होतीहै। एआईएम को आमतौर पर उनकी गंभीरता (जैसे, जब एक विशिष्ट एआईएम मौजूद होता है) और आयाम (उदाहरण के लिए, प्रत्येक आंदोलन के आयाम की विशेषता) 5,23,25 के आधार पर स्कोर किया जाता है।

एलआईडी के 6-ओएचडीए-घाव वाले कृंतक मॉडल चेहरे की वैधता पेश करते हैं (यानी, मॉडल में कई विशेषताएं हैं जो मानव स्थिति की तरह दिखती हैं) 5,11,26,27,28। कृंतक एआईएम, पीडी रोगियों में होने वाले समान, हाइपरकाइनेटिक (फोरलिम्ब और ओरोलिंगुअल) और डिस्टोनिक (अक्षीय) आंदोलनोंके रूप में देखा जाता है और पीक-डोज डिस्केनेसिया की नकल करता है। आणविक और कार्यात्मक स्तर पर, कृंतक मॉडल पीडी रोगियों के साथ कई रोग संबंधी विशेषताओं को साझा करते हैं5, जैसे कि फॉसबी / . भविष्य कहनेवाली वैधता के संबंध में, पीडी रोगियों में एलआईडी को कम करने वाली दवाएं (उदाहरण के लिए, एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए) रिसेप्टर विरोधी अमांताडाइन) कृंतक मॉडल22,36,37,38,39 में एंटीडिस्किनेटिक प्रभावकारिता प्रस्तुत करती हैं।

कृंतक एआईएम रेटिंग स्केल चार एआईएम उपप्रकारों के आधार पर बनाया गया था जिसमें सिर, गर्दन और ट्रंक (अक्षीय एआईएम), हाइपरकाइनेटिक फोरलिम्ब मूवमेंट (अंग एआईएम), और डिस्काइनेटिक जैसे ओरोलिंगुअल मूवमेंट (ओरोलिंगुअल एआईएम) को प्रभावित करने वाले एआईएम शामिल हैं। यद्यपि विपरीत रोटेशन (लोकोमोटिव एआईएम) एकतरफा घाव वाले कृन्तकों20,22,23,25,40 में भी मौजूद है, इसे डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलन के रूप में स्कोर नहीं किया गया है क्योंकि यह एलआईडी 22,37,41 के विशिष्ट माप का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है।

यहां, हम वर्णन करेंगे कि पीडी के गंभीर (>90%) एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे मॉडल में डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलनों (अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम) को कैसे प्रेरित और विश्लेषण किया जाए। हमने पिछले साहित्य और हमारी प्रयोगशाला विशेषज्ञता के आधार पर अपने प्रोटोकॉल का आयोजन किया।

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Protocol

सभी प्रयोग दर्शनशास्त्र, विज्ञान और रिबेरो प्रिटो के पत्रों के संकाय की आचार समिति (सीईयूए / एफएफसीएलआरपी 18.5.35.59.5) के अनुसार किए गए थे।

1. 6-ओएचडीए घाव

  1. प्रयोगों (6 सप्ताह) की शुरुआत में 200-250 ग्राम वजन वाले स्प्राग-डॉवले नर चूहों का उपयोग करें। मानक प्रयोगशाला स्थितियों (12:12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र, 06:00 घंटे पर रोशनी, तापमान-नियंत्रित सुविधाओं (22-24 डिग्री सेल्सियस) के तहत जानवरों (2-3 प्रति पिंजरे) को रखें, जिसमें भोजन और पानी उपलब्ध है।
    नोट: गंभीर 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों को उत्पन्न करने के तरीके का पूरा विवरण कहीं और वर्णित है।
  2. किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रिया की शुरुआत से पहले जानवरों को उचित रूप से अनुकूलित करें।
  3. सर्जरी से 30 मिनट पहले नॉरपेनेफ्रिन ट्रांसपोर्टर इनहिबिटर इमिप्रामाइन (20 मिलीग्राम / किग्रा, 0.9% खारा घोल में घुल गया) का प्रशासन करें ।
    नोट: इमिप्रामाइन प्रशासन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए 6-ओएचडीए चयनात्मकता में वृद्धि करेगा।
  4. केटामाइन / ज़ाइलज़िन (70/10 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  5. सुनिश्चित करें कि जानवर पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी से गहराई से एनेस्थेटाइज्ड है और हीटिंग पैड के शीर्ष पर स्टीरियोटैक्सिक तंत्र में एक प्रवण स्थिति में स्थित है।
  6. सिर पर फर को हटा दें और आयोडीन आधारित स्क्रब और अल्कोहल के बीच बारी-बारी से सर्जिकल क्षेत्र को 3 बार कीटाणुरहित करें।
  7. उस क्षेत्र में एक चीरा (लगभग 1 सेमी) बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें जहां माइक्रोइंजेक्शन होगा।
  8. कपास के स्वैब के साथ खोपड़ी क्षेत्र को साफ करें और सुनिश्चित करें कि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा उजागर हों।
  9. सुनिश्चित करें कि एमएफबी स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक ब्रेग्मा 43,44,45: -4.3 मिमी पूर्ववर्ती, 1.6 मिमी पार्श्व (दाईं ओर), और 8.3 मिमी उदर (ड्यूरा मेटर से) से लिए गए हैं।
  10. 6-ओएचडीए को 50 μL हैमिल्टन ग्लास सिरिंज का उपयोग करके दाएं मेडियल फोरब्रेन बंडल (MFB) में एकतरफा रूप से 0.4 μL/min (0.1% एस्कॉर्बिक एसिड युक्त खारा घोल के 4 μL में 10 μg) की दर से प्रशासित करें।
  11. सर्जरी के अंत में, खोपड़ी चीरा को सीवन करें और जानवर को गर्म (~ 37 डिग्री सेल्सियस) बाँझ 0.9% खारा घोल (~ 10 एमएल / किग्रा, एससी) के साथ पुन: हाइड्रेट करें।
  12. जानवर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से निकालें और इसे गर्म वसूली पिंजरे में रखें। होश में आने तक निगरानी रखें।
  13. स्टेपिंग टेस्ट 46,47 का उपयोग करके घाव के 4 सप्ताह बाद डोपामिनर्जिक घावकी प्रभावशीलता का आकलन करें।
    नोट: इस परीक्षण में, घाव के विपरीत अग्रभाग के अकिनेसिया का मूल्यांकन घाव के विपरीत फोरपॉ के साथ समायोजन चरणों की संख्या के माध्यम से किया जाता है। विपरीत अग्रभाग के साथ तीन या उससे कम समायोजन चरण प्रस्तुत करने वाले चूहों को अध्ययन में कथित रूप से 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहोंके रूप में शामिल किया गया है।

2. एल-डोपा क्रोनिक उपचार

  1. सोमवार को क्रोनिक उपचार शुरू करें, 6-ओएचडीए घाव के 4 सप्ताह बाद।
    नोट: चूंकि एआईएम को 3 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह लगातार 3 दिनों (बुधवार, गुरुवार और शुक्रवार) के लिए वीडियोटेप किया जाएगा, इसलिए सोमवार को उपचार शुरू करने की सिफारिश की जाती है।
  2. चूहों को ताजा तैयार एल-डोपा (चमड़े के नीचे (एससी), 1 एमएल / किग्रा) प्लस बेंसेराज़ाइड हाइड्रोक्लोराइड (क्रमशः 5 मिलीग्राम / किग्रा और 12.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ 3 सप्ताह के लिए इलाज करें, सोमवार से शुक्रवार45 तक रोजाना एक बार।
    नोट: एक बार स्थापित होने के बाद, एआईएम एल-डोपा के प्रत्येक प्रशासन के साथ प्रकट होंगे। इसलिए, 3 सप्ताह की प्रेरण अवधि के बाद सप्ताह में 2-4 बार एल-डोपा प्रशासन एआईएम48 की स्थिर अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त है।

3. एआईएम रिकॉर्डिंग और स्कोरिंग

  1. 09:00 घंटे और 17:00 घंटे के बीच प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि अन्वेषक चूहों की पहचान और औषधीय उपचार से पूरी तरह से अनजान है।
  2. सावधानी से चूहे को एक पारदर्शी सिलेंडर (20 सेमी व्यास x 40 सेमी लंबा) के अंदर रखें और इसे कम से कम 15 मिनट के लिए अनुकूलित करने दें। सुनिश्चित करें कि फर्श बिस्तर सामग्री के साथ कवर किया गया है। दर्पण को सिलेंडर के पीछे तैनात किया जाना चाहिए ताकि प्रयोगकर्ता सभी संभावित कोणों से जानवर का निरीक्षण कर सके।
    नोट: यदि प्रति प्रयोग एक से अधिक चूहे हैं, तो प्रत्येक चूहे के लिए एक सिलेंडर का उपयोग करें। सत्रों के बीच जानवरों का हेरफेर व्यवहार विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकता है।
  3. एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन वीडियो कैमरा को इस तरह से रखें जो अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम को देखने का पक्ष लेता है। चूंकि इन प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत घूर्णी व्यवहार मौजूद है, सिलेंडर के पीछे दर्पण 360 ° कोण पर एआईएम को ट्रैक करने की अनुमति देगा। एक ट्राइपॉड का उपयोग करें या कैमरे को सीधे बेंच पर ठीक करें।
    नोट: ओरोलिंगुअल एआईएम स्कोर करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर अगर घूर्णी व्यवहार की उच्च घटना है। विमान के थोड़ा नीचे स्थित कैमरे के साथ वीडियो कैप्चर करना जहां जानवर 15 ° कोण पर हैं, इस आंदोलन उपप्रकार का निरीक्षण करने में मदद करेगा।
  4. धीरे से सिलेंडर से जानवर को हटा दें और एल-डोपा (5 मिलीग्राम / किग्रा के साथ संयुक्त 12.5 मिलीग्राम / किग्रा बेन्सेराज़ाइड, एससी) का प्रशासन करें।
  5. जानवर को सिलेंडर में वापस रखें और एल-डोपा इंजेक्शन के बाद एआईएम को ट्रैक करने के लिए टाइमर शुरू करें। एल-डोपा के इंजेक्शन के बाद 180 मिनट के लिए एआईएम रिकॉर्ड करने के लिए एक वीडियो कैमरे का उपयोग करें। यद्यपि विश्लेषण जानवर के प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा किया जा सकता है, ऑफ़लाइन स्कोरिंग को प्राथमिकता दी जाती है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि टाइमर भी वीडियोटेप किया गया है ताकि एल-डोपा प्रशासन के बाद एआईएम को सटीक समय पर स्कोर किया जा सके।
  6. एल-डोपा इंजेक्शन के बाद 180 मिनट तक 30 मिनट के अंतराल पर एआईएम स्कोर करें (परिभाषाओं के लिए तालिका 1 देखें) जैसा कि शुरू में20,23 वर्णित है। स्कोर को 1-2 मिनट के युगों में दिया जाना चाहिए और अक्षीय, अंग, या ओरोलिंगुअल (चित्रा 1) के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए।
  7. गंभीरता और आयाम के लिए प्रत्येक एआईएम और विशेषता स्कोर का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें। निर्देशों के लिए तालिका 1 का उपयोग करें। रेटिंग में सामान्य व्यवहार, जैसे पालन, सूंघना, संवारना और कुतरना शामिल न करें। कुल छह अवलोकन अवधि (30, 60, 90, 120, 150 और 180 मिनट) होंगी।
उपप्रकारों
अक्षीय: सिर, गर्दन और ट्रंक का मरोड़
अंग: डिस्टल और समीपस्थ दोनों अग्रभाग के अनैच्छिक आंदोलन
ओरोलिंगुअल: ओरोफेशियल मांसपेशियों के अनैच्छिक आंदोलन
तेज
0: अनुपस्थित
1: सामयिक (रुकावटों के साथ, अवलोकन समय के आधे से भी कम समय में मौजूद)
2: लगातार (रुकावटों के साथ लेकिन अवलोकन समय के आधे से अधिक में मौजूद)
3: निरंतर लेकिन बाहरी संवेदी उत्तेजनाओं द्वारा बाधित
4: निरंतर और बाहरी संवेदी उत्तेजनाओं द्वारा बाधित नहीं
आयाम
अक्षीय
1. लगभग 30° कोण पर सिर और गर्दन का मरोड़
2. लगभग 30° < कोण पर सिर और गर्दन का मरोड़ 60° ≤
3. सिर, गर्दन और ऊपरी ट्रंक का लगभग 60° < कोण पर मरोड़ ≤ 90°
4: 90° कोण पर सिर, गर्दन और ट्रंक > मरोड़, जिससे अक्सर चूहा संतुलन खो देता है
अंग
1: डिस्टल फोरलिम्ब के छोटे अनैच्छिक आंदोलन
2: कम आयाम के आंदोलनों के कारण डिस्टल और समीपस्थ फोरलिम्ब दोनों का स्थानांतरण होता है
3: कंधे की मांसपेशियों सहित पूरे अंग के अनैच्छिक आंदोलन
4: मजबूत अंग और कंधे की गति, अक्सर बॉलिज़्म के समान
Orolingual
1: ओरोफेशियल मांसपेशियों के छोटे अनैच्छिक आंदोलन
2: जीभ प्रोट्रूशन के साथ उच्च आयाम के ओरोफेशियल आंदोलन

तालिका 1: एआईएमएस परिभाषा और रेटिंग मानदंड।

Figure 1
चित्रा 1: प्रत्येक एआईएम उपप्रकार दिखाने वाली तस्वीरों का अनुक्रम। (ए से ए")) अक्षीय एआईएम विभिन्न कोणों में डिस्टोनिक जैसी गतिविधियों को दर्शाता है (ए: 30 ° कोण, ए': 30 ° < कोण ≤ 60 ° , A": 60 ° < कोण ≤ 90 ° और A'": > 90 ° कोण)। (बी से बी") लिम्ब एआईएम (काले तीर) डिस्टल (बी और बी') और पूरे अग्रभाग (कंधे, बी "सहित) के अनैच्छिक आंदोलनों को दर्शाते हैं। (सी) जीभ प्रोट्रूशियंस के साथ उच्च आयाम का ओरोलिंगुअल एआईएम (लाल तीर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. एल-डोपा प्रशासन (यानी, छह अवलोकन अवधि) के बाद प्रत्येक अवलोकन अवधि के लिए गंभीरता और आयाम स्कोर को गुणा करके अक्षीय, अंग, या ओरोलिंगुअल एआईएम उपप्रकारों की गणना करें जैसा कि पहले वर्णित20 है। सैद्धांतिक अधिकतम स्कोर जो एक पशु एक परीक्षण सत्र में जमा कर सकता है वह 240 है (प्रति अवलोकन अवधि अधिकतम स्कोर 40 है, विवरण के लिए तालिका 1 देखें)।
  2. क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह में बुधवार, गुरुवार और शुक्रवार को दर्ज की गई सभी छह अवलोकन अवधियों के लिए प्लॉट एआईएम स्कोर (चित्रा 2)। क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह में प्रत्येक स्कोरिंग दिन (चित्रा 3) या प्रत्येक सप्ताह (चित्रा 4) पर प्रत्येक जानवर के अधिकतम स्कोर को इंगित करने के लिए एआईएम को अभिव्यक्त किया जा सकता है।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण दृष्टिकोण का चयन करने से पहले सत्यापित करें कि डेटा का सामान्य वितरण के करीब है या नहीं।
    नोट: एआईएम रेटिंग स्केल में क्रमिक डेटा होता है और गैर-पैरामीट्रिक आंकड़ों के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। बार-बार परीक्षण सत्र40 के बाद प्रयोगात्मक समूहों में एआईएम स्कोर की तुलना करते समय पैरामीट्रिक परीक्षणों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

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Representative Results

यद्यपि चूहों में देखे गए एआईएम पैटर्न मनुष्यों और गैर-मानव प्राइमेट्स में देखे गए लोगों की तुलना में सरल और सीमित हैं, यह मॉडल क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन द्वारा प्रेरित हाइपरकाइनेटिक और डिस्टोनिक जैसे आंदोलनों दोनों को पुन: पेश करता है। यहां हम एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों के एक समूह (एन = 10) से एकत्र किए गए डेटा को 3 सप्ताह (सोमवार से शुक्रवार) के लिए एल-डोपा (12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त 5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इलाज किया जाता है। ध्यान दें कि चित्रा 2, चित्रा 3 और चित्रा 4 में प्रस्तुत डेटा एक ही जानवरों से हैं।

चित्रा 2 क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह में अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम पर लागू स्कोर के लिए समय पाठ्यक्रम विश्लेषण दिखाता है। एक विशिष्ट अवलोकन अवधि में प्रत्येक एआईएम स्कोर उपप्रकार को इस विश्लेषण में गंभीरता और आयाम स्कोर के गुणन के रूप में रिपोर्ट किया गया है। इस प्रकार का विश्लेषण उन दवाओं के प्रभाव का पता लगाने के लिए सुविधाजनक हो सकता है जो एआईएम के अस्थायी प्रोफाइल में हस्तक्षेप करते हैं। ध्यान दें कि एल-डोपा-प्रेरित पीक-डोज डिस्केनेसिया इंजेक्शन के बाद 120 मिनट के बाद क्रमिक कमी के साथ 30-90 मिनट के बीच होता है (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों को क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन (12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त 5 मिलीग्राम / किग्रा) से अधिक अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम दिखाने वाले टाइम कोर्स विश्लेषण। (ए) अक्षीय, (बी) अंग, और (सी) ओरोलिंगुअल एआईएम को क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह में स्कोर किया गया था। प्रत्येक एआईएम उपप्रकार को छह अवलोकन अवधियों में से प्रत्येक पर गंभीरता समय आयाम के गुणन के रूप में रिपोर्ट किया गया है। प्रत्येक एआईएम उपप्रकार का व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जा सकता है या (डी) में इंगित किया जा सकता है। ध्यान दें कि क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के पहले सप्ताह के दौरान एआईएम की चरम गंभीरता धीरे-धीरे बढ़ेगी। डेटा को एसईएम (एन = 10) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 चित्रा 2 में दर्शाए गए सभी छह अवलोकन अवधियों के लिए प्रस्तुत एआईएम स्कोर का योग दिखाता है (डेटासेट आसान तुलना के लिए रंग-कोडित हैं)। यह विश्लेषण क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह में प्रत्येक स्कोरिंग दिन (बुधवार, गुरुवार और शुक्रवार) पर प्रत्येक जानवर के अधिकतम स्कोर को इंगित करता है। इस प्रकार का विश्लेषण संभावित एंटीडिस्किनेटिक प्रोफाइल वाले यौगिकों के प्रभाव का पता लगाने के लिए फायदेमंद हो सकता है, खासकर क्योंकि एआईएम स्कोर क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के सप्ताह 2 और 3 में स्थिर हैं। इसके अलावा, साप्ताहिक एआईएम स्कोर (चित्रा 4) बुधवार, गुरुवार और शुक्रवार को 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों के लिए जिम्मेदार स्कोर के योग से उत्पन्न किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह (12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त 5 मिलीग्राम / किग्रा) से 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों में व्यक्तिगत स्कोरिंग दिनों में अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम का योग। इस आंकड़े में, छह अवलोकन अवधियों में से प्रत्येक में प्रस्तुत एआईएम स्कोर ( चित्रा 2 किंवदंती में विवरण देखें) को सारांशित किया गया था। चित्रा 2 में प्रदर्शित डेटा के साथ तुलना करने के लिए अलग-अलग डेटासेट को रंग-कोडित किया गया था। यह विश्लेषण क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के 3 सप्ताह के बाद प्रत्येक स्कोरिंग दिन (बुधवार - डब्ल्यू, गुरुवार - टी, और शुक्रवार - एफ) पर प्रत्येक जानवर के अधिकतम स्कोर को इंगित करता है। (ए) अक्षीय, (बी) अंग, और (सी) ओरोलिंगुअल एआईएम। (डी) अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम का योग। एनोवा और होल्म-सिडक पोस्ट-हॉक परीक्षण से पता चला कि एल-डोपा के पुराने प्रशासन पर एआईएम धीरे-धीरे बढ़ते हैं। ध्यान दें कि एआईएम स्कोर क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के सप्ताह 2 और 3 में स्थिर हैं (* पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 बनाम बुधवार (डब्ल्यू) सप्ताह 1 पर)। डेटा को एसईएम (एन = 10) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन (12.5 मिलीग्राम / किलोग्राम बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त 5 मिलीग्राम / किग्रा) के दौरान साप्ताहिक अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम का योग 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों तक। इस आंकड़े में, एआईएम ने प्रत्येक सप्ताह स्कोर किया (बुधवार, गुरुवार और शुक्रवार - चित्रा 3 देखें) को सारांशित किया गया था। यह विश्लेषण क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के प्रत्येक सप्ताह में प्रत्येक जानवर के अधिकतम स्कोर को इंगित करता है। (ए) अक्षीय, (बी) अंग, और (सी) ओरोलिंगुअल एआईएम। (डी) अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल एआईएम का योग। एनोवा और होल्म-सिडक पोस्ट-हॉक परीक्षण से पता चला कि एल-डोपा (* पी < 0.05 बनाम सप्ताह 1) के पुराने प्रशासन पर एआईएम में वृद्धि हुई है। डेटा को एसईएम (एन = 10) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एमएफबी में 6-ओएचडीए के एकतरफा माइक्रोइंजेक्शन से प्रेरित पीडी के चूहे मॉडल में एआईएम को कैसे प्रेरित और विश्लेषण किया जाए। एल-डोपा (5 मिलीग्राम / किग्रा, 12.5 मिलीग्राम / किग्रा बेन्सेराज़ाइड के साथ संयुक्त) की कम खुराक के क्रोनिक दैनिक प्रशासन ने उपचार के 3 सप्ताह में एआईएम के विकास का उत्पादन किया। अस्थायी विश्लेषण से एआईएम की एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला, और एल-डोपा प्रशासन के बाद 30 से 90 मिनट के बीच पीक-डोज डिस्केनेसिया देखा जाता है। एआईएम अक्षीय, अंग और ओरोलिंगुअल मांसपेशियों को प्रभावित करने वाले दोहराए जाने वाले और उद्देश्यहीन आंदोलन हैं। प्रोटोकॉल और यहां प्रस्तुत डेटा पिछले साहित्य 22,23,49,50,51 से सहमत हैं।

अक्षीय, अंग, और ओरोलिंगुअल एआईएम रेटिंग स्केल बहुत संवेदनशील है क्योंकि यह समय की मात्रा (यानी, गंभीरता) को रेट करता है कि कृन्तक डिस्काइनेटिक जैसे आंदोलनों को प्रदर्शित करते हैं और इन आंदोलनों के आयाम को इंगित करतेहैं। एआईएम स्कोर को विभिन्न अस्थायी संकल्पों में व्यक्त किया जा सकता है (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) 17,18,19,52 देखें। कई अध्ययनों ने एआईएम के विकास पर एल-डोपा खुराक की भूमिका को संबोधित किया है। एल-डोपा (5-20 मिलीग्राम / किग्रा) की कम खुराक का क्रोनिक प्रशासन उपचार पर एआईएम के क्रमिक विकास का समर्थन करता है, जबकि एल-डोपा (25 मिलीग्राम / किग्रा या अधिक) की उच्च खुराक के परिणामस्वरूप एआईएम 23,25,27,53 का तेजी से और मजबूत विकास होता है। दिलचस्प बात यह है कि एल-डोपा 40,49,53 की कम खुराक के पुराने प्रशासन के बाद गंभीर 6-ओएचडीए-घाव वाले जानवरों का अनुपात एआईएम (या बहुत कम एआईएम स्कोर) विकसित नहीं कर सकता है। एल-डोपा के प्रशासन के मार्ग पर विचार करना भी आवश्यक है। यद्यपि एआईएम समान शुरुआत, समय प्रोफ़ाइल और गंभीरता ग्रेड40 साझा करते हैं, यह प्रदर्शित किया गया है कि खुराक-विफलता एपिसोड अक्सर इंट्रापरिटोनियल27 इलाज किए गए चूहों में होते हैं। इसके अलावा, एल-डोपा के प्रशासन ने प्लाज्मा स्तरों में अंतर-व्यक्तिगत भिन्नताएं पैदा कीं, एक प्रभाव जो एससी इंजेक्शन27 के बाद नहीं देखा गया था।

इस अध्ययन में, गंभीर निग्रोस्ट्रियल क्षति (डोपामिनर्जिक कमी के 90% से अधिक) वाले जानवरों में एआईएम स्पष्ट थे। स्ट्रिएटल डोपामिनर्जिक संक्रमण के बड़े पैमाने पर नुकसान को घाव48 के विपरीत फोरलिम्ब के साथ किए गए समायोजन चरणों की संख्या में कमी की विशेषता है। इसलिए, हम निग्रोस्ट्रियल मार्ग पर कथित गंभीर 6-ओएचडीए घावों वाले जानवरों का चयन करने के लिए स्टेपिंग टेस्ट की सलाह देते हैं। एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित रोटेशन टेस्ट का उपयोग आमतौर पर कथित 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों का चयन करने के लिए किया जाता है। एम्फ़ैटेमिन बरकरार स्ट्रेटम में डोपामाइन रिलीज को बढ़ाता है, और इस प्रकार यह इनरवेट और डिनेरवेट स्ट्रेटम के बीच मौजूदा असंतुलन को बढ़ाता है। हालांकि, 312 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों11 में किए गए एक दिलचस्प अध्ययन से एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित रोटेशन और टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज पॉजिटिव कोशिकाओं के बीच कोई संबंध नहीं पाया गया। इसी अध्ययन ने एम्फ़ैटेमिन-प्रेरित रोटेशन और एआईएम की गंभीरता के बीच एक खराब सहसंबंध दिखाया।

एआईएम के फेनोमेनोलॉजी और निग्रोस्ट्रियल डोपामिनर्जिक कमी के पैटर्न के बीच एक स्पष्ट संबंधहै। इस प्रोटोकॉल में हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले पीडी के 6-ओएचडीए चूहे मॉडल में एमएफबी में 6-ओएचडीए जलसेक के बाद निग्रोस्ट्रियल डोपामाइन टर्मिनलों की गंभीर एकतरफा कमी विकसित होती है। आंशिक रूप से डोपामाइन-क्षीण जानवरों की तुलना में पूरी तरह से डोपामाइन-क्षीण 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहों में एआईएम की अधिक घटनाएं होती हैं। 6-ओएचडीए घाव और क्रोनिक एल-डोपा प्रशासन के बाद न्यूरोपैप्टाइड्स डायनोर्फिन और एनकेफेलिन की स्ट्रिएटल अभिव्यक्ति का एक विस्तृत विश्लेषणकहीं और वर्णित है और पिछले साहित्य23,25 के अनुरूप है। आणविक स्तर पर, डिस्काइनेटिक कृन्तक पीडी और पीडी रोगियों के गैर-मानव प्राइमेट मॉडल में स्पष्ट डिस्केनेसिया से जुड़े आणविक मार्करों को साझा करते हैं, जैसे कि एएफओएसबी प्रतिलेखन कारक26,32,33,54 का स्ट्रिएटल अपरेग्यूलेशन। इसके अलावा, पीडी का कृंतक मॉडल एल-डोपा उपचार55 के जवाब में स्ट्रेटम में माइक्रोवाइल घनत्व में वृद्धि दिखाता है, इसी तरह पीडी रोगियों के पुटामेन में देखा गयाहै। एलआईडी के कृंतक मॉडल क्लिनिक में उपयोग किए जाने वाले एंटीडिस्किनेटिक फार्माकोलॉजिकल दृष्टिकोणों का जवाब देते हैं, जैसे कि एनएमडीए रिसेप्टर विरोधी अमांताडीन 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. कुल मिलाकर, सबूत के ये टुकड़े एलआईडी के पैथोफिज़ियोलॉजी को चिह्नित करने और एंटीडिस्किनेटिक गुणों वाले यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए 6-ओएचडीए चूहे मॉडल की चेहरे की वैधता और भविष्यवाणी वैधता की पुष्टि करते हैं। ट्रांसजेनिक चूहों में एलआईडी के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एलआईडी का चूहों का मॉडल भी एक मूल्यवान उपकरण है। एलआईडी के चूहों के मॉडल के लिए प्रोटोकॉल विभिन्न शोध समूहों 30,57,58 के कागजात में पाया जा सकता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एलआईडी के 6-ओएचडीए-घाव वाले कृंतक मॉडल की सीमाएं हैं। 6-ओएचडीए-प्रेरित डोपामिनर्जिक कमी पीडी रोगी5 में निग्रोस्ट्रियल कमी की प्रगतिशील प्रकृति की तुलना में तीव्र है। इसके अलावा, रोगियों में एंटीडिस्किनेटिक दवा का उपयोग करने के लिए एक उत्कृष्ट चिकित्सीय खिड़की ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि दवा की खुराक बढ़ाने से एल-डोपा द्वारा उत्पादित लाभकारी प्रभाव में हस्तक्षेप हो सकता है या साइड इफेक्ट्स को प्रेरित कर सकता है जो पशु मॉडल59,60 में नहीं देखा गया हो सकता है। एलआईडी के चूहे के मॉडल की एक और सीमा कृन्तकों में एआईएम के बीच शारीरिक समानता की कमी है और रोगियों और गैर-मानव प्राइमेट्स10,61,62 में देखे गए कोरिफॉर्म आंदोलनों की अभिव्यक्ति है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक और संभावित सीमा यह है कि एल-डोपा प्रशासन के बाद हर 30 मिनट में एआईएम स्कोर किए जाते हैं, लेकिन इस मुद्दे को प्रबंधित किया जा सकता है यदि प्रयोगकर्ता एल-डोपा प्रशासन के बाद 180 मिनट के लिए सभी जानवरों को वीडियोटेप करता है। प्रयोगकर्ता तब अधिक लगातार स्कोरिंग के लिए स्कोरिंग प्रोटोकॉल को समायोजित कर सकता है (उदाहरण के लिए, हर 10 या 20 मिनट)। यह दृष्टिकोण उन प्रयोगों में फायदेमंद है जिनके लिए एआईएम टाइम कोर्स की अधिक गतिशील तस्वीर की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, एआईएम स्कोरिंग और विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल या न्यूरोकेमिकल रिकॉर्डिंग का संयोजन)।

अंत में, एलआईडी का 6-ओएचडीए चूहा मॉडल रोग के पैथोफिज़ियोलॉजी को पुन: पेश करता है और एआईएम विकसित करता है जिसे चिकित्सकीय रूप से उपयोग की जाने वाली दवाओं द्वारा संशोधित किया जा सकता है। यद्यपि इसकी सीमाएं हैं, एलआईडी का 6-ओएचडीए चूहा मॉडल अभी भी ट्रांसलेशनल क्षमता के साथ प्रभावी एंटीडिस्किनेटिक हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए एक अमूल्य प्रीक्लिनिकल उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (एफएपीईएसपी, अनुदान 2017/00003-0) द्वारा समर्थित किया गया था। हम उच्च शिक्षा कर्मियों के सुधार के लिए समन्वय (सीएपीएस) के लिए आभारी हैं। हम समर्थन और सलाह के लिए डॉ एंथनी आर वेस्ट, डॉ हेंज स्टेनर और डॉ कुई वाई त्सेंग को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

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जीव विज्ञान अंक 176 पार्किंसंस रोग बेसल गैन्ग्लिया 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया असामान्य अनैच्छिक आंदोलन
पार्किंसंस रोग के एकतरफा 6-ओएचडीए-घाव वाले चूहे मॉडल में एल-डोपा-प्रेरित डिस्केनेसिया की रेटिंग
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Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

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