Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Мы представляем экспериментальный протокол и рабочий процесс анализа данных для выполнения двухцветной флуоресцентной перекрестной корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки.

Abstract

Мы представляем протокол и рабочий процесс для выполнения двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с переносом резонансной энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки. В двухцветной FCCS, где колебания интенсивности флуоресценции представляют собой динамический «отпечаток» соответствующей флуоресцентной биомолекулы, мы можем исследовать кодиффузию или связывание рецепторов. FRET, с его высокой чувствительностью к молекулярным расстояниям, служит известным «нанорулером» для мониторинга внутримолекулярных изменений. Взятые вместе, конформационные изменения и ключевые параметры, такие как концентрации местных рецепторов и константы подвижности, становятся доступными в клеточных условиях.

Количественные флуоресцентные подходы являются сложными в клетках из-за высокого уровня шума и уязвимости образца. Здесь мы покажем, как выполнить этот эксперимент, включая этапы калибровки с использованием двухцветного меченого β2-адренергического рецептора (β2AR), помеченного eGFP и SNAP-tag-TAMRA. Пошаговая процедура анализа данных предоставляется с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом и шаблонов, которые легко настроить.

Наше руководство позволяет исследователям разгадывать молекулярные взаимодействия биомолекул в живых клетках in situ с высокой надежностью, несмотря на ограниченные уровни сигнал-шум в экспериментах с живыми клетками. Рабочее окно FRET и особенно FCCS при низких концентрациях позволяет проводить количественный анализ в почти физиологических условиях.

Introduction

Флуоресцентная спектроскопия является одним из основных методов количественной оценки динамики белка и белково-белковых взаимодействий с минимальным возмущением в клеточном контексте. Конфокальная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) является одним из мощных методов анализа молекулярной динамики, поскольку она чувствительна к одной молекуле, очень селективна и совместима с живыми клетками1. По сравнению с другими подходами, ориентированными на динамику, FCS имеет более широкий измеримый диапазон времени, охватывающий от ~ ns до ~ s, что наиболее важно для охвата быстрых временных масштабов, которые часто недоступны методами на основе визуализации. Кроме того, он также обеспечивает пространственную селективность, так что мембранная, цитоплазматическая и молекулярная динамика ядра могут быть легко различимы 2. Таким образом, молекулярное моргание, средняя локальная концентрация и коэффициент диффузии могут быть количественно проанализированы с помощью FCS. Межмолекулярная динамика, такая как связывание, становится легко доступной при прозондировании кодиффузии двух молекулярных видов в флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (FCCS) анализ3,4,5 в двухцветном подходе.

Основным основополагающим принципом корреляционной спектроскопии является статистический анализ флуктуаций интенсивности, излучаемых флуоресцентно мечеными биомолекулами, диффузными в лазерном фокусе и из него(рисунок 1А). Полученные авто- или кросс-корреляционные функции затем могут быть дополнительно проанализированы путем подгонки кривой, чтобы в конечном итоге получить процентные константы скорости. Другими словами, статистические методы FCS и FCCS обеспечивают не следы одной молекулы, как при отслеживании одной частицы, а динамический паттерн или «отпечаток пальца» исследуемого образца с высоким временным разрешением. В сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) внутримолекулярная динамика, такая как конформационные изменения, может контролироваться одновременно в общей конфокальной установке5,6. FRET исследует расстояние двух флуорофоров и часто упоминается как молекулярный «нанорулер». Передача энергии происходит только тогда, когда молекулы находятся в непосредственной близости (< 10 нм), спектр излучения донора значительно перекрывается со спектром поглощения молекулы-акцептора, а дипольная ориентация донора и акцептора (достаточно) параллельна. Таким образом, комбинация FRET и FCCS обеспечивает технику с очень высоким пространственно-временным разрешением. Когда требуется пространственная селективность, чувствительность, а также совместимость с живыми клетками, FRET-FCCS имеет очевидное преимущество перед другими методами, такими как изотермическая титрационная калориметрия (ITC)7,поверхностный плазмонный резонанс (SPR)8или ядерный магнитный резонанс (ЯМР)9,10 для измерения динамики и взаимодействий белков.

Несмотря на возможности и перспективность двухцветной флуоресцентной перекрестно-корреляционной спектроскопии (dc-FCCS), выполнение dc-FCCS в живых клетках технически сложно из-за спектрального кровотечения или перекрестных помех между каналами3,4,разницы в конфокальных объемах из-за спектрально четких лазерных линий3,4,11,фонового сигнала и шума или ограниченной фотостабильности образцов12, 13,14,15. Введение импульсного чередующегося возбуждения (PIE) в FCCS было важной настройкой для временного разъежевания различных лазерных возбуждений для уменьшения спектральных перекрестных помех между каналами16. Другие методы коррекции для противодействия спектральному кровотечению17,18,19 и фоновым коррекциям также были хорошо приняты17,18,19. Для получения подробной информации и основ о FCS, PIE или FRET читатель обращается к следующим ссылкам2,4,6,16,20,21,22,23,24.

Здесь представлены все необходимые калибровочные эксперименты и анализ вместе с экспериментальными результатами прототипа рецептора, связанного с G-белком, β 2-адренергического рецептора (β2AR), для трех различных сценариев: (1) одномаркированные молекулы, несущие либо «зеленый» (eGFP), либо «красный» (маркировка на основе SNAP-метки)25 флуорофор; (2) двойная маркировка, которая несет N-концевую SNAP-метку и внутриклеточный eGFP (NT-SNAP) [в этом случае обе метки находятся на одном и том же белке. Таким образом, ожидается 100% кодиффузия]; и (3) образец с двойной маркировкой, где оба флуорофора находятся на одной стороне клеточной мембраны (CT-SNAP). Он несет C-терминал SNAP-метку и внутриклеточный eGFP. Здесь, опять же, обе метки находятся на одном и том же белке с ожидаемой 100% кодиффузией. Поскольку обе метки находятся очень близко друг к другу, на одной стороне клеточной мембраны, это показывает потенциал для наблюдения FRET и антикоррелированного поведения. Все конструкции были трансфектированы в клетки китайского хомячка (CHO), а затем помечены красной флуоресцентной подложкой, которая является мембранопроницаемой для конструкции NT-SNAP и мембранопроницаемой для конструкции CT-SNAP. Наконец, смоделированные данные иллюстрируют влияние экспериментальных параметров на антикоррелацию, индуцированную FRET, и влияние белково-белковых взаимодействий на амплитуду кодиффузии.

Таким образом, этот протокол предоставляет полное руководство по выполнению комбинированного FRET-FCCS в живых клетках для понимания динамики белка и белково-белковых взаимодействий, а также для ознакомления с техническими / физическими артефактами, проблемами и возможными решениями.

Protocol

1. Экспериментальный протокол

  1. Пробоподготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить посев и трансфекцию клеток в стерильных условиях.
    1. Поместите очищенный покровный лист на скважину в 6-скважинную культурную пластину и трижды промыть стерильным фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол очистки крышки подробно описан в Дополнительном примечании 1.
    2. К каждой скважине добавляют 2 мл полной клеточной культуральной среды, содержащей феноловый красный (дополненный 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 мкг/ мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и держите пластину в стороне.
    3. Культивьять клетки CHO в той же среде, содержащей фенол красный при 37 °C и 5% CO2. Промыть клетки 5 мл PBS, чтобы удалить мертвые клетки.
    4. Добавить 2 мл трипсина и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
    5. Разбавьте отсоединенные ячейки 8 мл среды, содержащей фенол красный, и тщательно перемешайте путем пипетирования.
    6. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра и семена при плотности 1,5 х 105 клеток/скважину в 6-скважинной пластине для культивации клеток, содержащей покровные листы (подготовленной на этапе 1.1.1-1.1.2).
    7. Дайте клеткам расти в инкубаторе (37 °C, 5% CO2)в течение 24 ч, чтобы достичь примерно 80% конфюсации.
    8. Разбавляют 2 мкг желаемой векторной ДНК (например, CT-SNAP или NT-SNAP) и 6 мкл трансфекционного реагента в двух отдельных пробирках, каждая из которых содержит 500 мкл восстановленной сывороточной среды для каждой скважины и инкубируют в течение 5 мин при РТ.
    9. Смешайте два раствора вместе для получения трансфекционной смеси и инкубировать ее в течение 20 мин при РТ.
    10. Тем временем промыть посеянные cho-клетки один раз стерильным PBS.
    11. Замените PBS 1 мл / веллу фенольного среды без красного цвета, дополненной 10% FBS без каких-либо антибиотиков.
    12. Добавьте весь 1 мл трансфекционной смеси по каплям в каждую скважину и инкубируют клетки в течение ночи при 37 °C, в 5% CO2.
    13. Для маркировки конструкции SNAP разбавляют соответствующий раствор подложки SNAP в 1 мл среды, дополненной 10% FBS для получения конечной концентрации 1 мкМ.
    14. Промыть трансфекированные клетки один раз PBS и добавить 1 мл на скважину 1 мкМ раствора субстрата SNAP. Инкубируют клетки в течение 20 мин при 37 °C в 5% CO2.
    15. Трижды промыть клетки фенольно-красной средой и добавить 2 мл на хорошо фенольную среду без красного цвета. Инкубируют клетки в течение 30 мин при 37 °C в 5% CO2.
    16. Затем перенесите крышки всех образцов в камеру визуализации и промыть буфером визуализации объемом 500 мкл. Добавьте буфер изображений 500 мкл перед переходом к установке FRET-FCS.
  2. Калибровочные измерения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка FRET-FCS оснащена конфокальным микроскопом с водным объективом, двумя лазерными линиями, системой подсчета одиночных фотонов с корреляцией по времени (TCSPC), двумя гибридными фотоумноживательными трубками (PMT) и двумя лавинными фотодиодами (APD) для сбора фотонов и программным обеспечением для сбора данных. Очень важно выравнивать настройку каждый раз перед измерениями живых клеток. Подробное описание установки можно найти в Дополнительном примечании 2. Как лазеры, так и все детекторы (два PMT и два APD) всегда включены во время измерений, так как все измерения должны проводиться в одинаковых условиях. Для калибровочных измерений используйте крышку из той же партии, на которой были посеяны клетки, это уменьшает вариации в коррекции воротникового кольца.
    1. Для регулировки фокуса, положения точечного отверстия и воротникового кольца поместите 2 нМ зеленого калибровочного раствора на стеклянный покров и включите лазер 485 нм и 560 нм. Работа лазера в режиме импульсного чередуемого возбуждения (PIE)16.
    2. Сосредоточьтесь на растворе и отрегулируйте положение точечного отверстия и воротникового кольца таким образом, чтобы получить наибольшую скорость подсчета и наименьший конфокальный объем для получения максимальной молекулярной яркости.
    3. Повторите этот процесс для красных каналов с 10 нМ красного калибровочного раствора и смесью зеленого и красного калибровочного раствора.
    4. Поместите раствор ДНК 10 нМ на стеклянную крышку и отрегулируйте фокус, точечное отверстие и положение воротникового кольца таким образом, чтобы перекрестная корреляция между зеленым и красным каналами обнаружения была самой высокой, то есть показывает самую высокую амплитуду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.2.1 и 1.2.4, возможно, придется повторять вперед и назад для нахождения оптимального выравнивания. Пройдите 3-5 измерений из каждого калибровочного раствора в течение 30 с - 120 с после того, как фокус, точечное отверстие и положение кольца воротника были оптимально выровнены для зеленого и красного каналов обнаружения и конфокального объема перекрытия.
    5. Измерьте каплю ddH2O, среду визуализации и неперетераженные клетки по 3-5 раз каждый в течение 30 с - 120 с, чтобы определить скорость фонового количества.
    6. Соберите функцию отклика прибора с 3-5 измерениями за 30 с - 120 с. Это необязательно, но настоятельно рекомендуется.
  3. Измерения живых клеток
    1. Найдите подходящую ячейку, осветив ртутной лампой и наблюдая через глаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящие клетки живы, показывая типичную морфологию соответствующей клеточной линии адгезивов. Флуоресценция интересуемого белка, здесь поверхностного рецептора, видна по всей поверхности. Менее яркие клетки более подходят, чем более яркие, из-за лучшей контрастности в FCS, когда в фокусе находится небольшое количество молекул.
    2. Включите оба лазера в режиме PIE и сосредоточьтесь на мембране, глядя на максимальное количество в секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется уменьшить мощность лазера для образцов клеток (менее 5 мкВт на объективе). Это зависит от используемых флуорофоров и настроек.
    3. Наблюдайте за кривыми автоматической и перекрестной корреляции eGFP или помеченной SNAP-метки, прикрепленной к β2AR в онлайн-предварительном просмотре программного обеспечения для сбора данных, и соберите несколько коротких измерений (~ 2 -10) со временем сбора между 60 -180 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не возбуждайте клетки в течение длительного времени непрерывно, так как флуорофоры могут отбеливаться. Однако это будет зависеть от яркости каждой ячейки, от того, как долго могут быть измерения, и сколько измерений в общей сложности может быть выполнено.

2. Анализ данных

  1. Экспорт данных
    1. Экспортируйте кривые корреляцииG(tc)и подсчитывайте скорости, CR, из всех измерений.
    2. Позаботьтесь о том, чтобы правильно определить временные окна «подсказка» и «задержка» и используйте опцию «микротайминг» в программном обеспечении для корреляции данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всего требуется три различные корреляции: (1) автокорреляция зеленого канала в окне подсказки времени(ACFgp),(2) автокорреляция красных каналов в окне времени задержки(ACFrd)и, наконец, (3) перекрестная корреляция сигнала зеленого канала в окне времени подсказки с сигналом красного канала в окне времени задержки(CCFPIE). Экспорт данных показан шаг за шагом для различных программ в Дополнительном примечании 3.
  2. Калибровочные измерения
    1. Используйте автокорреляционные функции зеленого(ACFgp)и красного(ACFrd)флуорофорных растворов и подгоняйте их к 3D-модели диффузии с дополнительным триплетным термином, если это необходимо (экв. 1), чтобы откалибровать форму и размер конфокального объема обнаружения для двух используемых цветовых каналов:
      Equation 1 экв. 1
      Здесь b — базовая линия кривой, N — число молекул в фокусе, tD — время диффузии (в мс), а s = z0/w0 — форм-фактор конфокального объемного элемента. Триплетное моргание или другая фотофизика описывается его амплитудой r и временем релаксации tR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все переменные и символы, используемые в протоколе, перечислены в таблице 1.
    2. Используйте известные коэффициенты диффузии D для зеленого26 и красного калибровочного стандарта27 и полученные форм-факторы sзеленый и sкрасный для определения размеров (ширина w0 и высота z0)и объема Veff конфокального объемного элемента (экв. 2a-c).
      Equation 2экв. 2а
      Equation 3экв. 2b
      Equation 4экв. 2c
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны для расчета параметра калибровки предоставляются в виде дополнительных файлов (S7).
    3. Рассчитайте спектральные перекрестные помехи α зеленого флуоресцентного сигнала (собранного в каналах 0 и 2) в красные каналы детектирования (каналы No 1 и 3) в качестве соотношения фоновых скорректированных (BG) сигналов (экв. 3).
      Equation 5
      экв. 3
    4. Определяют прямое возбуждение акцепторного флуорофора δ длиной волны возбуждения донора по соотношению фоново-скорректированной скорости подсчета красных калибровочных измерений в «подсказке» временного окна (возбуждение зеленым лазером) к фоново-скорректированной скорости счета в временном окне «задержки» (возбуждение красным лазером) (экв. 4).
      Equation 6
      экв. 4
    5. Рассчитайте молекулярную яркость B как зеленых, так и красных флуорофоров (экв. 5a-b) на основе фоновых скорректированных скоростей подсчета и полученного числа молекул в фокусе, N,из 3D-диффузионного соответствия (экв. 1):
      Equation 7экв. 5a
      Equation 8экв. 5b
    6. Подгонка как ACFgp, так и ACFrd, а также CCFPIE двойной меченой ДНК к 3D-модели диффузии (экв. 1). Сохраняйте полученные форм-факторы, sзеленый и sкрасный,постоянные для ACFgp и ACFrdсоответственно. Форм-фактор для CCFPIE,sPIE, обычно находится между этими двумя значениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеальной установке, как Veff,зеленый, так и Veff, красный будет иметь одинаковый размер и идеально перекрываться.
    7. Определяют амплитуду при нулевом времени корреляции G0(tc),исходя из найденных значений кажущееся число молекул в фокусе(Nзеленый, Nкрасный и NPIE).
    8. Рассчитайте соотношение амплитуд rGR и rRG для образца со 100% кодиффузией зеленых и красных флуорофоров (экв. 6). Имейте в виду, что NPIE не отражает количество двух меченых молекул в фокусе, а отражает только 1/G0(tc).
      Equation 9и Equation 10 экв. 6
  3. Эксперименты с живыми клетками
    1. Для одномаркированных конструкций подгоняйте образцы клеток к соответствующей модели. Для показанного мембранного рецептора диффузия происходит бимодальным образом с коротким и длительным временем диффузии. Кроме того, фотофизика и моргание флуорофоров должны быть рассмотрены:
      Equation 11 экв. 7
      Здесь td1 и td2 являются двумя требуемыми временами диффузии, а 1 — долей первого времени диффузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от калибровочных измерений, в которых свободные красители и нити ДНК свободно диффундируют во всех направлениях, мембранный рецептор показывает только 2D-диффузию вдоль клеточных мембран. Это различие между 3D и 2D диффузией отражается модифицированным термином диффузии (сравните экв. 1), где tD в 2D-случае не зависит от форм-фактора s конфокального объемного элемента.
    2. Рассчитайте концентрацию c зеленых или красных меченых белков из соответствующих N и Veff, используя базовую математику (экв. 8):
      Equation 12экв. 8
      где NA = число Авогадро
    3. Для N-концевой метки SNAP и внутриклеточной eGFP подогнать две автокорреляции(ACFgp и ACFrd)образца с двойной меткой, используя ту же модель, что и для одномаркированных конструкций для ACF (eq. 7) и CCFPIE с использованием бимодальной диффузионной модели (eq. 9):
      Equation 13экв. 9
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для глобального описания системы все три кривые должны быть подогнаны вместе: термин диффузии идентичен для всех трех кривых, и единственным различием является термин релаксации для CCFPIE. Поскольку фотофизика двух флуорофоров обычно не связана, термин корреляции не требуется. Это отсутствие терминов релаксации приводит к плоскому CCFPIE при коротком времени корреляции. Однако перекрестные помехи и прямое возбуждение акцептора из-за донорского флуорофора могут показывать ложноположительные амплитуды и должны быть тщательно проверены на использование калибровочных измерений.
    4. Рассчитайте концентрацию c зеленых или красных меченых белков из соответствующих N и Veff, используя уравнение 8.
    5. Оценить фракцию или концентрацию, cGR или cRG,взаимодействующих зеленых и красных меченых белков из образцов клеток, используя поправочные коэффициенты, полученные из образцов ДНК, амплитудные соотношения rGR и rRG образца клетки и их соответствующие полученные концентрации (экв. 10).
      Equation 14 и Equation 15 экв. 10
    6. Для C-концевой метки SNAP и внутриклеточной eGFP подогнать две автокорреляции(ACFgp и ACFrd)образца FRET в качестве одномаркированных образцов (уравнение 7) и CCFFRET к бимодальной диффузионной модели, содержащей антикорреляторный член (уравнение 11).
      Equation 16 экв. 11
      гдеf отражает амплитуду общей антикоррелии, аR и tR - соответствующую амплитуду и время релаксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае антикоррелированных флуоресцентных изменений, вызванных FRET, может потребоваться один или несколько антикорреляторных терминов (экв. 11), что приводит к «падению» CCFFRET при низких времени корреляции, совпадающих с ростом двух автокорреляций(ACFgp и ACFrd). Однако имейте в виду, что фотофизика, такая как триплетное моргание, может маскировать антикорреляционный термин, ослабляя антикорреляцию, вызванную FRET. Совместный анализ, дополненный отфильтрованными методами FCS, может помочь разоблачить антикоррелянтный термин. Кроме того, технические артефакты, происходящие из мертвых времен в счетной электронике в диапазоне наносекунд, должны быть исключены16. Более подробная пошаговая процедура выполнения анализа в ChiSurf28 и шаблоны для расчета конфокального объема или молекулярной яркости представлены в репозитории Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) и в качестве дополнительных файлов(Дополнительное примечание 4 и Дополнительное примечание 6). Кроме того, там можно найти python-скрипты для пакетного экспорта данных, полученных с помощью программного обеспечения Symphotime в формате .ptu.

Representative Results

Примерные результаты калибровки и измерений живых клеток обсуждаются ниже. Кроме того, продемонстрировано влияние FRET на кривые перекрестной корреляции на основе смоделированных данных рядом с эффектом белково-белкового взаимодействия, увеличивающего амплитуду CCFPIE.

Экспорт данных FCS на основе PIE
В экспериментах PIE данные собираются в режиме time-tag time-resolved mode (TTTR)29,30. На фиг.1В показаны гистограммы времени прибытия фотонов измерения PIE двойной меченой нити ДНК на описаннойустановке (Дополнительное примечание 1). Установка имеет четыре канала обнаружения. Флуоресцентное излучение сначала расщепляется поляризацией в направлениях «S» и «P» (имеется в виду перпендикулярная и параллельная плоскость, в которой колеблется электрическое поле световой волны). Во-вторых, каждое направление поляризации затем разделяется на два цветовых канала (зеленый, красный) перед обнаружением, в результате чего получается четыре канала (S-зеленый, S-красный, P-зеленый, P-красный). В «подсказке» временного окна зеленый флуорофор возбуждается, и сигнал обнаруживается как в зеленом, так и в красном каналах благодаря FRET. В окне времени задержки виден только красный флуорофор (в красном канале). На основе каналов обнаружения и «подсказок» и «отложенных» временных окон можно получить не менее пяти различных кривых корреляции (3 кривые автокорреляции (ACF) и 2 кривые перекрестной корреляции (CCF))(рисунок 1C-D):(1) зеленый сигнал в окне подсказки времени(ACFgp),(2) красный сигнал в окне подсказки времени (в случае FRET, ACFrp), и (3) красный сигнал в окне времени задержки(ACFrd). Эти ACF сообщают о подвижности белка, фотофизике (например, триплетное моргание) и других коррелированных по времени изменениях яркости во флуорофорах (например, из-за FRET). (4) Кросс-корреляционный CCF PIE на основе PIE зеленого сигнала в окне подсказки времени с красным сигналом в окне времени задержки позволяет определить долю кодиффузии зеленого и красного флуорофора16. (5) Перекрестная корреляция КФГЛАД зеленого с красным сигналом в окне подсказки связана с вызванными FRET антикоррелированными изменениями яркости в зеленых и красных сигналах31,32,33.

Figure 1
Рисунок 1:Флуоресцентная (перекрестная) корреляционная спектроскопия (F(C)CS) на основе флуоресцентного (PIE) на основе флуоресцентного возбуждения (PIE) (F(C)CS). (A)В FCS флуоресцентно меченые молекулы свободно диффундируют в (дифракционно-ограниченном) фокальный объем, сформированный сфокусированным лазерным лучом, который индуцирует флуоресценцию в этом крошечном объеме. Результирующие флуктуации интенсивности молекул, входящих и выходящих из объема, коррелируют и дают информацию о подвижности молекул. (B) В PIE две разные лазерные линии («подсказка» и «задержка») используются для возбуждения образца, помеченного двумя различными флуорофорами («зеленый» и «красный»). Разница во времени между обоими импульсами возбуждения адаптирована к времени жизни флуоресценции соответствующих флуорофоров таким образом, что один из них распадается до возбуждения другого. В показанном образце с двойной маркировкой оба флуорофора находятся достаточно близко, чтобы пройти резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) из «зеленого» донорского флуорофора в «красный» акцепторный флуорофор. Таким образом, красное флуоресцентное излучение может быть обнаружено в «подсказке» временного окна при возбуждении зеленого донора. В используемойустановке (Дополнительное примечание 2)для каждого цвета используются два детектора, один из которых ориентирован параллельно ориентации пучка возбуждения (обозначается "p"), а второй перпендикулярен (обозначается "s"). (C) В эксперименте PIE могут быть определены три различные функции автокорреляции: корреляция i) сигналов зеленого канала в окне времени подсказки(ACFgp),ii) сигналов красного канала в окне времени подсказки(ACFrp)и iii) сигналов красного канала в окне времени задержки(ACFrd). (D) Можно определить две различные кросс-корреляционные функции: iv) перекрестная корреляция "PIE"(CCFPIE)с сигналами зеленого канала в окне быстрого времени, коррелируемыми с сигналами красного канала в окне задержки, где амплитуда этой кривой связана с кодиффузией флуорофоров; и v) перекрестная корреляция "FRET"(CCFFRET)с сигналами зеленого канала в окне подсказки, коррелированной с сигналами красного канала в том же окне подсказки; здесь форма этой кривой в разы быстрее диффузии связана с изменениями интенсивности, вызванными FRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Калибровка
На рисунке 2А-В показано калибровочное измерение диффузионно рассеивающихся зеленых и красных флуорофоров соответственно. На основе соответствия с экв. 1 и известным коэффициентом диффузии Dзеленый26 и Dкрасный27 форма(z0 и w 0)и размер(Veff)объема детектирования рассчитываются с использованием экв. 2a-c. Результаты подгонки ACFgp из зеленого флуорофора и ACFrd из красного флуорофора обобщены на рисунке 2C. Оба флуорофора показывают дополнительную константу времени релаксации 8,6 мкс (18%) и 36 мкс (15%) соответственно. Молекулярная яркость (экв. 5a-b) зеленого и красного флуорофора составляет 12,5 кГц на молекулу и 2,7 кГц на молекулу соответственно.

Для достоверной оценки размера и формы конфокального объема, а также молекулярной яркости рекомендуется выполнить 3-5 измерений за один калибровочный эксперимент и совместную (или глобальную) подгонку всех повторов.

Перекрестные α(рисунок 2D,экв. 3) и прямое возбуждение акцептора зеленым лазерным δ(рисунок 2E,экв. 4) для этой флуорофорной пары лежат на уровне ~15% и ~38% соответственно.

Figure 2
Рисунок 2:Калибровочные измерения свободно диффузного зеленого и красного калибровочного стандарта. (A-B)Репрезентативное измерение 60 с измерения 2 нМ зеленого(A)и 10 нМ красного(B)калибровочного стандарта, установленного на 3D-модели диффузии, включая дополнительное время релаксации(экв. 1). Таблица на панели(C)показывает результаты подгонки и производный параметр на основе экв. 2a-c и экв. 5a-b. *Коэффициенты диффузии взяты из литературы26,27. (D)Определение перекрестных помех α зеленого сигнала в красные каналы(экв. 3). Спектр возбуждения зеленого стандарта показан в синю, спектр излучения — зеленым. Лазерные линии возбуждения при 485 нм (синий) и 561 нм (оранжевый) показаны в виде пунктирных линий. Прозрачные зеленые и пурпурные поля показывают собранный диапазон выбросов(Дополнительное примечание 2). (E)Определение прямого возбуждения δ красного флуорофора лазером 485 нм (экв. 4). Цветовой код идентичен (D), светло- и темно-оранжевый показывают спектр возбуждения и излучения красного стандарта соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для определения и калибровки перекрытия зеленого и красного объема возбуждения используется двойная меченая двойная нить ДНК(рисунок 3А),как описано выше. Здесь флуорофоры расположены на 40 bp друг от друга, так что между зелеными и красными флуорофорами, прикрепленными к концам двойных нитей ДНК, не может возникнуть FRET. На рисунке 3B показаны автокорреляции от обоих флуорофоров зеленого(ACFgp)и пурпурного цвета(ACFrd),а также корреляция PIE-кросса, CCFPIE,в циане. Обратите внимание, что для CCFPIE сигнал в зеленых каналах в окне подсказки времени коррелирует с сигналом в красных каналах в окне времени задержки16.

Здесь получен средний коэффициент диффузии для цепи ДНК DДНК = 77 мкм²/с. Более подробную информацию о расчете можно найти в пошаговом протоколе, Дополнительное примечание 4. Это значение получают путем вставки калиброванного размера зеленого и красного объемов детектирования(рисунок 2)и соответствующих времен диффузии ACFgp и ACFrd цепи ДНК(рисунок 3C)в уравнение 2a. Далее, используя полученные значения коррекции rGR и r RG и используя экв. 6 далее, количество кодиффузии, т.е. двухмаркированных молекул (или белковых комплексов в случае ко-трансфекции двух разных белков) может быть определено из образцов клеток.

Figure 3
Рисунок 3:Калибровка зелено-красного перекрывающегося объема с использованием образца ДНК. (A)Цепь ДНК, используемая для калибровки, несет зеленый и красный калибровочный флуорофор с расстоянием 40 bp между ними. Расстояние между междурядьями должно быть достаточно большим, чтобы исключить FRET между флуорофорами. (B) Репрезентативное измерение 60 с раствора ДНК 10 нМ. Автокорреляции как из флуорофоров зеленого цвета(ACFgp,зеленый стандарт) и пурпурного цвета(ACFrd,красный стандарт) и PIE-кросскорреляции, CCFPIE,синего цвета. Таблица на панели(C)показывает результаты подгонки на основе модели 3D-диффузии, включая дополнительный релаксационный термин(eq. 1)и производный коэффициент диффузии параметра ДНК, DДНК (eq. 2a),размер и форму перекрывающегося объема(eq. 2a-c)и коэффициенты коррекции rGR и rRG (экв. 6 ). Обратите внимание, что значения для зеленого и красного объема обнаружения (помеченные *) были взяты из подгонки отдельных флуорофоров, показанных на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эксперименты с живыми клетками
В следующем разделе представлен анализ экспериментов с живыми клетками для различных ar-конструкций β2. Поскольку β2AR является мембранным белком, его диффузия в значительной степени ограничена двумерной диффузией(фиг.4A)вдоль клеточной мембраны (за исключением процессов транспортировки или рециркуляции в мембрану или из нее)2. С ограничением 2D-диффузии форм-фактор s = z0/w0 в экв. 1 устаревает, что приводит к упрощенной диффузионной модели (экв. 9).

Одномеглечные конструкции: β2AR-IL3-eGFP и NT-SNAP-β2AR
На рисунке 4 показаны примерные измерения однометочной конструкции β2AR-IL3-eGFP(рисунок 4B),где eGFP вставляется во внутриклеточную петлю 3, и конструкции NT-SNAP-β2AR(рисунок 4C),где тег SNAP сопряжен с N-концем β2AR. Метка SNAP маркируется мембранопроницаемой поверхностной подложкой SNAP. Репрезентативные кривые показывают в среднем 4-6 повторных измерений со временем получения 120 - 200 с каждое. Соответствующие автокорреляции ACFgp и ACFrd сигнала eGFP и SNAP установлены на бимодальную двумерную диффузионную модель (экв. 9). С точки зрения быстрой динамики, eGFP показывает только ожидаемое мигание триплета при tR1 ~ 9 мкс, в то время как сигнал SNAP требует двух раз релаксации, одно при типичном времени триплетного мигания tR1 ~ 5 мкс, а второе при tR2 ~ 180 мкс.

Молекулярная яркость флуорофоров в живых клетках составляет 0,8 кГц (eGFP) и 1,7 кГц (SNAP) на молекулу при заданных условиях возбуждения (экв. 5a-b). Концентрация меченых β2AR-конструкций, включенных в клеточную мембрану, должна находиться в наномолярном диапазоне и может быть определена средним числом молекул (экв. 9, фиг.4С)и размером соответствующего конфокального объема для зеленого и красного канала(фиг.2)с использованием экв. 8.

Figure 4
Рисунок 4:Репрезентативное измерение однометочных конструкций. (A) В этом исследовании в качестве примера использовался мембранный рецептор β2AR. В отличие от флуорофоров и нитей ДНК, используемых для калибровки, которые могли свободно плавать через объем обнаружения, мембранные белки диффундируют в основном латерально вдоль мембраны, описываемой как 2-мерная диффузия. (Б, Д) ACFgp и ACFrd однобукветочных конструкций β2AR-IL3-eGFP(B)и NT-SNAP-β2AR(D). Показано среднее значение 4-6 измерений, каждое из которых собрано за 120 - 200 с. Таблица на панели(C)показывает соответствие результатов данных бимодальной двумерной диффузионной модели, включая дополнительные условия релаксации(eq. 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Конструкция с двойной маркировкой: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
В двухмаркированной конструкции NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (короткая NT-SNAP) eGFP вставляется во внутриклеточную петлю 3, а тег SNAP сопряжен с N-концем β2AR(рисунок 5A). В этой конфигурации eGFP находится на внутренней стороне мембраны, а SNAP на внешней стороне со слишком большими расстояниями для FRET. В идеальном случае эта конструкция показала бы 100% кодиффузию зеленого и красного флуорофора, и без сигнала FRET. На рисунке 5B-D показаны два измерения NT-SNAP в двух ячейках в два разных дня измерения. Подгонка ACFgp и ACFrd «лучшего» измерения, показанного на рисунке 5B, с экв. 7 и CCFPIE с экв. 9, показывает 50-60 молекул в фокусе для ACFgp и ACFrd,тогда как приложениеN, таким образом, 1/G0(tc) ~ 114 для CCFPIE (рисунок 5C ). Концентрация меченых рецепторов находится в диапазоне ~100 нМ, как определено с экв. 8. Для определения средней концентрации двухмаркированных молекул, во-первых, рассчитывается отношение G0(tc)(представленное 1/N(app)) CCFPIE к ACFgp и ACFrdсоответственно (экв. 6). Далее эти значения, rGRcell= 0,43 и rRGcell = 0,53, сравниваются со значениями, полученными из измерения ДНК(rGR, ДНК= 0,51 и rRG, ДНК = 0,79 в этот день измерения). Используя правило пропорций, rGRcell= 0,43 от ACFgp сигнала eGFP отражается на долю кодиффузии(rGRcell/rGR,DNA)0,84, где для другого случая ACFrd сигнала подложки SNAP это значение составляет 0,67. Средняя концентрация конструкции NT-SNAP с двойной меткой может быть окончательно рассчитана на основе экв. 10. Напротив, в измерении, показанном на рисунке 5D с другого дня, концентрация рецепторов довольно низкая, а данные очень шумные, так что диапазон подгонки ограничен до ~ 10 мкс. Кроме того, наблюдается лишь низкое количество кодиффузии (15 – 26%).

Figure 5
Рисунок 5:Двойная маркировка NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP конструкция. (A) В конструкции с двойной меткой eGFP вставляется во внутриклеточную петлю 3, а метка SNAP прикреплена к N-конце β2AR (NT-SNAP). (Б, Д) ACFgp, ACFrd и CCFPIE двух измерений конструкции с двойной маркировкой. Данные подходят к бимодальной двумерной диффузионной модели(eq. 9, CCFPIE)и включены дополнительные релаксационные термины(eq. 7, ACFgp и ACFrd). Таблица на панели(C)показывает результаты подгонки и производный параметр концентрации(экв. 8),отношение амплитуды корреляции при нулевом времени корреляции (G0(tc))и доли кодиффузных молекул(экв. 10). Обратите внимание, что измерения были получены в разные дни, таким образом, был использован несколько разный коэффициент для коррекции амплитуды (B: rGR, ДНК = 0,51 и r RG, ДНК = 0,79; D: rGR,ДНК = 0,51 и rRG,ДНК = 0,56). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Конструкция с двойной маркировкой, проходящей FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
В конструкции с двойной меткой β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(рисунок 6A)eGFP вставляется во внутриклеточную петлю 3, идентичную конструкции NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP с меткой SNAP, прикрепленной к C-конце. Здесь обе метки находятся на одной стороне плазматической мембраны клеток, так что флуорофоры находятся в непосредственной близости, так что FRET происходит, как указано в закаленном времени жизни eGFP(Дополнительное примечание 5). Учитывая гибкость относительно неструктурированных белковых областей, таких как С-концевая34 и, по меньшей мере, две различные белковые конформации GPCR35,«высокий FRET» (HF) или «низкий FRET» (LF), динамические изменения эффективности FRET из-за изменений расстояния eGFP-SNAP могут наблюдаться и идентифицироваться антикорреляционным термином в CCFFRET (оранжевая кривая на рисунке 6B). ). Было показано, что флуктуации FRET антикоррелированы, поскольку рецептор может находиться только в одном состоянии за раз, либо HF, либо LF. Совместное (или глобальное) соответствие всех пяти корреляционных кривых(рисунок 6B)показывает ~ 70% медленно диффундируя молекул при ~ 100 мс, в то время как остальные диффундируют с ~ 1 мс. Все автокорреляции и КФГFRET показывают условия релаксации при 37 мкс и 3 мкс; корреляции, в которых доминирует красный сигнал(ACFrp, ACFrd и CCFFRET),показывают дополнительную медленную составляющую ~ 50 мс(рисунок 6C).

Вызванные FRET изменения на ФРЕТ КФГ в различных условиях(рисунок 6D)демонстрируются серией симуляций двухгосударственной системы со временем флуктуации 70 мкс между НЧ и ВЧ состояниями. При переключении из НЧ в ВЧ состояние в окне подсказки наблюдаются изменения антикоррелированного сигнала: зеленый сигнал уменьшается, а красный сигнал увеличивается (наоборот для кв-> НЧ-переключения). Если переключение HF-LF происходит на временных масштабах быстрее, чем время диффузии, другими словами, во время пребывания молекулы в фокусе, скорость может быть получена из антикорреляции в CCFFRET6,31,36. Обратите внимание, что динамические процессы медленнее времени диффузии не могут наблюдаться в FCS.

В этой демонстрации были приняты два различных сценария FRET, показывающих либо умеренное, либо максимальное изменение эффективности FRET между двумя состояниями. Моделирование проводилось с использованием Burbulator37 и учитывалось отсутствие или наличие мигания триплета и увеличение количества донорских перекрестных помех в красных каналах. Диффузионный термин был смоделирован как бимодальное распределение с 30% быстродиффузных молекул при tD1 = 1 мс, а остальные молекулы медленно диффузируют с tD2 = 100 мс. В общей сложности было смоделировано10 7 фотонов в 3D-гауссовом объеме с w0 = 0,5 мкм и z0 = 1,5 мкм, размером коробки 20 и NFCS = 0,01.

На рисунке 6E-F показаны результаты моделирования для FRET-индуцированного перекрестной корреляции CCFFRET для умеренного(рисунок 6E)и максимального контраста FRET(рисунок 6F)при отсутствии (сплошные линии) и наличии триплетного мигания (пунктирные линии). Антикоррелия, индуцированная FRET, легко видна на рисунке 6F. Эффект «демпфирования» при добавлении дополнительного триплетного состояния уменьшает амплитуду корреляции(рисунок 6E-F)38,39.

Figure 6
Рисунок 6:Моделирование образца с двойной маркировкой, показывающей динамический FRET. (A) Двойная метка β2AR с eGFP, вставленным во внутриклеточную петлю 3 и C-концевой меткой SNAP. Оба флуорофора находятся достаточно близко, чтобы пройти FRET и показать изменения в эффективности FRET, если рецептор подвергается белковой динамике. (B) Автокорреляция(ACFgp, ACFrp и ACFrd,соответствуют экв. 7) и перекрестные корреляционные кривые(CCFFRET (eq. 7) и CCFPIE (экв. 9)) примера измерения. Таблица на панели(C)показывает результаты подгонки. (Д-Ф) Чтобы показать влияние экспериментального параметра на ожидаемый, FRET-индуцированный антикорреляционный термин, было выполнено 12 симуляций, в которых моделировали изменение эффективности FRET (малое или большое), различное количество донорских перекрестных помех в акцепторные каналы (0%, 1% или 10%) и отсутствие и наличие триплетного моргания. Равновесная доля обоих FRET-состояний предполагалась равной 50:50 и их обменные курсы корректировались таким образом, что полученное время релаксации tR = 70 мкс. Подробнее о симуляциях смотрите в тексте. (E) CCFFRET результатов моделирования с умеренным контрастом FRET и при отсутствии перекрестных помех (темно-оранжевый), 1% перекрестных помех (оранжевый) и 10% перекрестных помех (светло-оранжевый). Сплошные линии показывают результаты при отсутствии триплета, пунктирные линии при наличии триплета. (F) CCFFRET результатов моделирования с максимальной контрастностью FRET. Цветовой код идентичен (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Однако в моделировании наиболее похоже на экспериментальные условия (α = 10%, 15% триплетного мигания и умеренный контраст FRET, пунктирная желтая линия на рисунке 6E),антикорреляционный термин почти уменьшен. На фиг.7 показан результат анализа этих смоделированных данных с использованием информации, закодированной в гистограммах времени прибытия фотонов (т.е. времени жизни флуоресценции) с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FLCS)17,19 или FCS с фильтрацией видов (fFCS)18. Здесь время жизни флуоресценции известных видов HF и LF(рисунок 7A)используется для генерации весов или «фильтров»(рисунок 7B),которые применяются во время процедуры корреляции. В полученных видо- и кросс-корреляционных кривых(рис. 7С-D)отчетливо прослеживается антикорреляция.

Figure 7
Рисунок 7:FcS с фильтрацией по времени жизни может помочь выявить флуктуации эффективности FRET на основе динамики белка в образцах с высоким перекрестным помехом, значительным триплетным миганием или другими фотофизическими или экспериментальными свойствами, маскируя антикоррелляцию, вызванную FRET, в CCFFRET. Здесь показан примерный подход для данных, показанных на рисунке 6E для моделирования, содержащего 10% перекрестных помех и 5% триплетного мигания. (A)Нормализованные модели распада интенсивности флуоресценции для двух видов FRET (светло-зеленый и темно-зеленый для высокого и низкого FRET, соответственно) и IRF (серый). Паттерн для параллельного канала обнаружения показан в сплошных линиях, пунктирных линиях для перпендикулярного канала обнаружения. (B) Функция взвешивания или «фильтр» были сгенерированы на основе шаблонов, показанных в (A), цветовой код идентичен (A). Обратите внимание, что здесь рассматривается только сигнал в зеленых каналах обнаружения и, следовательно, закалка донора, вызванная FRET. (C)Получены четыре различные видоселективные корреляции: виды-аутокорреляции низкого состояния FRET(sACFLF-LF, темно-зеленый)и высокого состояния FRET(sACFHF-HF,светло-зеленый), и два вида-перекрестные корреляции между низким FRET и высоким состоянием FRET(sCCFLF-HF, темно-оранжевый)и наоборот(sCCFHF-LF) и наоборот (sCCF HF-LF , оранжевый). SCCF четко показывает антикорреляцию в μs-диапазоне. Пунктирные черные линии показывают припадки. sACF соответствовали eq. 9 и sCCF eq. 11. Таблица на панели (D) показывает результаты подгонки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Амплитуда CCFPIE для изучения белково-белкового взаимодействия (PPI)
Наконец, общим вариантом использования FCS на основе PIE в живых клетках является изучение взаимодействия между двумя различными белками. Здесь параметром считывания является амплитуда CCFPIE,или точнее отношение амплитуд автокорреляции ACFgp и ACFrd к амплитуде CCFPIE. Чтобы показать влияние увеличения кодиффузии на CCFPIE,моделирование было выполнено на основе двух одномаркированных конструкций, β2AR-IL3-eGFP и NT-SNAP-β2AR(рисунок 8A). На рисунке 8B показано, как увеличивается амплитуда CCFPIE, когда доля кодиффузных молекул изменяется от 0% до 100%. Обратите внимание, что 1% перекрестных помех зеленого сигнала в красные каналы в окне времени задержки было добавлено с компонентами диффузии, смоделированными в противном случае, как показано выше.

Figure 8
Рисунок 8: CCFPIE может быть использован для изучения взаимодействия двух белков. (A) Здесь было смоделировано ко-трансфекционное исследование β2AR-IL3-eGFP с NT-SNAP-β2AR (несущей «красную» SNAP-метку). (B)Для увеличения количества кодиффузных молекул (0% (темно-синий) -> 100% (светло-голубой)) амплитуда G(tc)увеличивается. Диффузионный термин был снова смоделирован как бимодальное распределение с 30% быстродиффузионных молекул при tD1 = 1 мс, а остальные молекулы медленно диффузируют с tD2 = 100 мс. Кроме того, было добавлено 1% перекрестных помех зеленого сигнала в красное окно времени задержки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Символ Значение (общая единица)
α перекрестные помехи зеленого флуорофора после зеленого возбуждения в красные каналы детектирования (%)
а1 фракция первого диффузионного компонента в бимодальной диффузионной модели мембранных рецепторов
аф общая амплитуда антикорреляционного термина
аР амплитуда фотофизики/триплетного моргания
b базовая линия / смещение корреляционной кривой
B молекулярная яркость флуорофора ((кило-)считается на молекулу в секунду)
БГ фон (например, из соответствующего эталонного образца: ddH2O, буфер, нетрансфицированная ячейка и т.д.)
c концентрация
ЧР скорость подсчета (кГц или (кило-) количество в секунду)
δ прямое возбуждение красного флуорофора после зеленого возбуждения (%)
D коэффициент диффузии (мкм²/с)
G(tc) корреляционная функция
N количество молекул в фокусе
НА Номер Авогадро (6.022*1023 Мол-1)
рГР, рРГ амплитудное отношение функции автокорреляции зеленого или красного к функции перекрестной корреляции на основе PIE
s форм-фактор конфокального объемного элемента
тс время корреляции (обычно в миллисекундах)
тД время диффузии (обычно в миллисекундах или микросекундах)
тР время релаксации фотофизики (обычно в микросекундах)
тТ время релаксации триплетного моргания (обычно в микросекундах)
ш0 половинная ширина конфокального объемного элемента (мкм)
z0 половинная высота конфокального объемного элемента (мкм)

Таблица 1: Перечень переменных и сокращений. Для использования символов и определений в экспериментах по флуоресценции и FRET рекомендуются руководящие принципы сообщества FRET40.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФАЙЛЫ:

SuppNote1_Coverslip очистки.docx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

SuppNote2_Confocal Установка.docx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

SuppNote3_Data экспорт.docx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

SuppNote4_FCCS калибровочный анализ с помощью ChiSurf.docx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

SuppNote5_Fluorescence гистограммы времени жизни.docx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

S6_Scripts.zip Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

S7_Excel_templates.zip Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Методы FCS в GPCR позволяют оценить подвижность и взаимодействие рецепторов внутри живых клеток41. Преимущество метода FRET-FCS заключается в том, что наряду с мобильностью можно исследовать конформационную динамику GPCR. Тем не менее, выполнение FRET-FCS в живых клетках является сложной задачей и требует клеток, которые показывают низкую (или максимально умеренную) экспрессию интересующего флуоресцентно меченого белка, хорошо откалиброванную установку и хороший конвейер для анализа данных. Здесь сначала обсуждаются критические точки в подготовке образцов и экспериментальной процедуре, касающиеся биологической, спектроскопической и технической точек зрения.

Критические экспериментальные этапы включают минимизацию фона и автофлуоресценции (путем использования широко очищенных покровных листков и фенол-красных свободных сред), оптимизацию условий трансфекции (например, количество плазмидной ДНК и время после трансфекции) для достижения низких уровней экспрессии и эффективной маркировки. Конечно, также важно убедиться, что функция меченого белка не затруднена. Таким образом, в экспериментах с живыми клетками решение о стратегии маркировки и позиции этикетки часто принимается в пользу флуоресцентных белков или метки SNAP/CLIP, прикрепленной к гибкому N- или C-конце42,43. Альтернативные стратегии маркировки, такие как введение неестественной аминокислоты с реакционноспособной боковой цепью для маркировки органическим флуорофором, появились в последние годы44.

Для двухцветного PIE-FCS, где исследуется только взаимодействие двух молекул, представляющих интерес, флуорофоры могут быть выбраны из большого разнообразия установленных флуоресцентных белков или субстратов SNAP/CLIP. Здесь, с точки зрения спектроскопии, цель должна состоять в том, чтобы выбрать пару таким образом, чтобы возникали небольшие перекрестные помехи или прямое акцепторное возбуждение. Кроме того, выбранные флуорофоры должны быть фотостабильные и практически не отбеливаться в выбранных экспериментальных условиях. Рекомендуется выбирать флуорофоры в красном спектральном диапазоне, так как (1) фон автофлуоресценции из клетки уменьшается и (2) свет возбуждения имеет более длинную длину волны, следовательно, менее фототоксичная14. Фотоотбеливание можно свести к минимуму, проведя сначала так называемый «степенный ряд», в котором мощность лазера увеличивается ступенчато, а молекулярная яркость наблюдается. Оптимальный диапазон интенсивности возбуждения лежит в линейном диапазоне результатов45.

Если предполагается, что эти две метки также сообщают о конформационной динамике белка через FRET, то выбор доступных флуорофоров более ограничен. Здесь возможное минимальное/максимальное расстояние между двумя флуорофорами должно быть оценено заранее, например, на основе имеющихся структур или размера молекул, и пары флуорофоров, выбранной с разумным радиусом Фёрстера R0, так что FRET действительно может встречаться20.

Здесь для маркировки были выбраны eGFP и метка SNAP, а метка SNAP была помечена либо внутриклеточной, либо мембранопроницаемой поверхностной подложкой. Спектры аналогичны тем, которые показаны на рисунке 2C-D. Эта комбинация флуорофоров показывает высокие перекрестные помехи eGFP в красные каналы обнаружения и прямое акцепторное возбуждение субстрата SNAP зеленым возбуждением в окне быстрого времени и приводит к значительному «ложному» сигналу в красных каналах в окне быстрого времени. В идеале оба значения, перекрестный разговор и прямое акцепторное возбуждение, не должны превышать5% 5,6,38. Однако с радиусом Фёрстера 57 Å он идеально подходит для исследования расстояния между метками в конструкции β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, который может быть оценен по закаленному сроку службы eGFP (Дополнительное примечание 5).

Технически, как и для любого эксперимента по флуоресцентной спектроскопии, устройство должно быть хорошо выровнено и должно иметь подходящие источники возбуждения, эмиссионный фильтр и чувствительные детекторы. Чтобы избежать артефактов от послепульсии детектора на временной шкале μs, должно присутствовать, по крайней мере, два детектора каждого цвета, которые могут быть перекрестно коррелированы. В современной электронике для подсчета одиночных фотонов с корреляцией по времени мертвое время карты обнаружения в диапазоне времени ns вряд ли играет роль из-за независимых каналов маршрутизации, однако оно может быть проверено, как предложено Мюллером и др. 16, при условии, что диапазон времени, представляющий интерес, лежит в диапазоне времени ниже мкс / нс. Кроме того, для еще более высоких временных разрешений в диапазоне ps каждый канал обнаружения должен быть удвоен, то есть следует использовать четыре детектора на цвет, чтобы также обойти детектор мертвых раз2,15,29,46. В то время как среднее время жизни флуоресценции может быть оценено с использованием неполяризованного флуоресцентного обнаружения, для анализа расстояния (~ распределения) между флуорофорами излучение должно быть собрано в зависимости от поляризации. Это связано с тем, что эффективность передачи энергии в FRET зависит от ориентации двух флуорофоров. Более подробную информацию можно найти здесь20,28,47. Наконец, в экспериментах PIE расстояние между импульсом подсказки и задержки является критическим и должно быть выбрано таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции флуорофоров была в значительной степени распалась(рисунок 1B). Общее правило состоит в том, чтобы поместить два импульса в 5 раз больше времени жизни флуоресценции друг от друга, т.е. для eGFP со сроком службы флуоресценции 2,5 нс расстояние должно составлять 12,5 нс при минимум22.

После детального рассмотрения всех соображений по экспериментальной процедуре, данные и их анализ обсуждаются более подробно. Как упоминалось в разделе протокола, выравнивание установки должно проверяться ежедневно, включая анализ калибровочных измерений. Данные, показанные на рисунке 2A-C, например, показывают дополнительный компонент релаксации в диапазоне 8-40 мкс. Типичное триплетное мигание зеленого калибровочного флуорофора, как известно, происходит в диапазоне 2-10 мкс13,15,48. Компонент медленной релаксации, необходимый во всех кривых образца ДНК(рисунок 3C),слишком медленный для фактического триплетного мигания, может быть связан с взаимодействием ДНК с флуорофорами39. Однако этот компонент не ожидается в CCFPIEи, скорее всего, связан с остаточными перекрестными помехами. Таким образом, крайне желательно выполнить анализ калибровочных образцов непосредственно перед тем, как приступить к экспериментам с клетками, чтобы судить о качестве выравнивания дня.

Правильная калибровка конфокального перекрывающего объема требует образца со 100% кодиффузией зеленой и красной метки. Здесь используется флуоресцентно меченая двухцепочечная ДНК. Обе нити ДНК могут быть адаптированы так, чтобы иметь желаемые флуорофоры на необходимом расстоянии друг от друга. Разработанные пряди можно отжигать с высокой урожайностью. Тем не менее, Надлежащая лабораторная практика советует проверять целостность и степень маркировки нитей ДНК с помощью электрофореза агарозного геля и измерения спектра поглощения. Кроме того, следует проверить выход двухцепочечной сборки, поскольку это калибровочное измерение критически опирается на предположение о том, что существует 100% совместное распространение зеленого с красной меткой. В случае, если предположение неверно, возможно, придется применить поправочный коэффициент16,22. В калибровочных измерениях, показанных на фиг.2 и фиг.3,был получен объем обнаружения 1,4 л и 1,9 л в зеленом и красном канале соответственно. Эта разница в размерах ожидается для установки с почти дифракционными объемами возбуждения(Дополнительное примечание 2). При этом условии размер объема возбуждения масштабируется с длиной волны возбуждения. Это, в свою очередь, объясняет различные амплитуды корреляции, наблюдаемые на рисунке 3B. Производные поправочный коэффициент r GR = 0,56 и rRG = 0,72 с поправкой на это расхождение размеров и потенциальное неисполнение перекрытия двух объемов возбуждения3,4.

Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6и Рисунок 7 демонстрируют рабочий процесс исследования на основе PIE-F(C)CS, направленного на понимание конформационной динамики белка. Во-первых, две одномаркированные конструкции β2AR-IL3-eGFP и NT-SNAP-β2AR служат элементами управления для характеристики свойств флуорофора в клетках в отсутствие соответствующего другого флуорофора(рисунок 4). Далее, двойная маркировка NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP, несущая SNAP-метку, обращенную к внешней стороне клетки, и eGFP на цитоплазматической стороне, служит в качестве элемента управления «100% кодиффузией»(рисунок 5). Последняя конструкция, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, несет оба флуорофора на цитоплазматической стороне и достаточно близко друг к другу, чтобы пройти FRET. Здесь снова можно было бы ожидать 100% кодиффузии в тандеме с антикоррелированной флуктуациями интенсивности сигнала зеленого и красного каналов в оперативном временном окне, т. е. после возбуждения донора, за счет динамики белка, влияющей на эффективность FRET31,32,33. Эта динамика может проявляться как антикоррелия в КФГ ФРТ (рисунок 6-7).

Все конструкции GPCR β2AR показывают бимодальную диффузию на клеточной мембране(рисунок 4A). В то время как β2AR-IL3-eGFP показывает только ожидаемое триплетное мигание(рисунок 5B)13,15,NT-SNAP-β2AR показывает дополнительное медленное время релаксации(рисунок 5C-D). Вполне вероятно, что tR2 может быть связан с несвязанным субстратом SNAP. Это может быть выяснено дальнейшими экспериментами, например, путем измерения диффузионных и фотофизических свойств используемой подложки SNAP в водном растворе. Следует отметить, что простой эксперимент по различению времени диффузии и релаксации заключается в изменении точечного отверстия конфокальной установки, то есть увеличении эффективного объема: в то время как время диффузии увеличивается с увеличением эффективных объемов, условия релаксации не изменяются13. При определении концентрации флуоресцентного белка (ФП) на основании результатов подгонки следует учитывать, что FP в целом подвергаются процессу созревания, в результате которого в конечном итоге образуетсяхромофор 12. Это время созревания может отличаться от FP к FP в дополнение к фотофизике, которая зависит от локальной химической среды13,15. Таким образом, фактическая концентрация белка, присутствующая в образце, сообщаемом FCS, обычно недооценивается, что может быть скорректировано, если в эксперименте может быть определена доля нефлуоресцентных FP. Наконец, желательно проверить спектры флуорофоров в живых клетках, чтобы скорректировать значения для α и δ, если это необходимо, так как большинство флуорофоров реагируют чувствительно к окружающей среде13,15,48. Фон для вычитания определяется сигналом, собранным в неперепраженные клетки. Кроме того, автокорреляция соответствующего другого цветового канала и CCFPIE должна быть проверена, чтобы иметь возможность идентифицировать ложные сигналы(Дополнительное примечание 4 - Рисунок 30).

Два измерения из NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP(рисунок 5D),где флуорофоры расположены на разных сторонах мембраны, были получены в разные дни и показывают важность статистики в флуоресценции одной молекулы с временным разрешением. Здесь различные результаты могут быть обусловлены различной степенью маркировки: в одной ячейке более высокая степень маркировки и усреднения измерений привела к относительно низкому уровню шума(рисунок 5B),в то время как из другой ячейки можно было собрать только два измерения(рисунок 5A). Помимо сбора достаточного количества данных, крайне важно своевременно оценить результаты и, возможно, оптимизировать стратегию маркировки. При проектировании экспериментов важно помнить, что FRET чувствителен, но ограничен расстояниями до 10 нм и «слеп» в противном случае. В нашем случае на эту «слепоту» указывает неизменный срок службы флуоресценции eGFP (Дополнительное примечание 5). В β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(рисунок 6A)FRET может быть точно определен по закаленному сроку службы eGFP (Дополнительное примечание 5). Однако антикорреляционный термин не наблюдается(рисунок 6B),что означает, что FRET либо не колеблется, либо в масштабе времени медленнее, чем время диффузии. В ACFgp,ACF rp,ACF rdи CCFFRET требуется до трех дополнительных условий релаксации(рисунок 6C). Медленный компонент в ACFrp, ACFrd и CCFFRET может быть обусловлен акцепторным отбеливанием и, конечно же, влияет на полученное значение медленной диффузии, обнаруженной в этих кривых (~ 350 мс по сравнению с 117 мс в ACFgp). tD в красном канале предполагается немного больше, чем в зеленом канале из-за различных размеров конфокальных объемов(рисунок 2)- но только в коэффициенте, сопоставимом с разницей в размерах. Очень быстрое время релаксации 3 мкс отражает триплетное мигание флуорофоров13,15,48,тогда как более медленное время релаксации 37 мкс может быть связано с FRET: аналогично, поскольку FRET индуцирует антикорреляцию в CCFFRET,положительные корреляции ожидаются в автокорреляциях31,32,33. Присутствие этого термина как «позитивного» в КФГ ФРЭ И его присутствие в АКФможно объяснить высоким перекрестным разговором и следует дополнительно прояснить. Обратите внимание, что CCFPIE является плоским при коротком времени корреляции, как и ожидалось.

С другой стороны, следует отметить, что появление FRET в интересууемой системе приводит к нелинейным воздействиям на корреляционные кривые6. Молекулярная яркость, например, молекулы масштабируется в квадратную амплитуду корреляции, и каждое FRET-состояние (и всегда присутствующие молекулы без активного рецептора) показывает различную молекулярную яркость. Действительно, FRET уменьшает видимую концентрацию обнаруженных зеленых молекул (т.е. увеличивает амплитуду ACFgp), а количество красных молекул (определяемых по красному подсказке) завышено5. Оба эффекта влияют на степень взаимодействия, полученного как из CCFFRET, так и из CCFPIE. Однако глобальный анализ, как показано, например, для внутримолекулярной динамики Calmodulin 31,32 или Syntaxin33, может выявить динамику белка. При тщательной калибровке средняя эффективность FRET может быть извлечена из относительных амплитуд22 CCFPIE и ACF, тогда как предельные состояния могут быть определены из анализа распределения33срока службы донорской флуоресценции.

Учитывая тот факт, что в экспериментах с живыми клетками с большими флуорофорами, такими как eGFP, контраст FRET, вероятно, будет даже ниже, чем предполагалось для моделирования, показанного на рисунке 6, и что прямое возбуждение акцептора не было добавлено в моделировании, может объяснить, почему идентификация антикоррелации в экспериментах с живыми клетками очень сложна. Многообещающая альтернатива анализа основана на сборе информации, закодированной в гистограммах времени прибытия фотонов(рисунок 1B),доступных благодаря коррелированному по времени сбору данных подсчета одиночных фотонов29,30. Если время жизни флуоресценции (~паттерны) двух (или более) (FRET) видов внутри образца известно(рисунок 7A),можно выбрать «фильтр» или веса, которые применяются в процессе корреляции(Рисунок 7B)17,18,19. Полученные таким образом корреляционные кривые больше не представляют собой корреляцию каналов обнаружения, а скорее авто- или перекрестные корреляции между двумя различными (FRET) видами, поэтому переименованные в вид-ACF (sACF) или вид-CCF (sCCF). Применение этого подхода к смоделированным данным с умеренной контрастностью FRET, высоким перекрестным помехом и триплетным миганием восстанавливает антикорреляционный термин(рисунок 7C-D). Однако следует отметить, что время релаксации может быть получено, но связь с амплитудой теряется18. Этот подход применялся ранее в экспериментах с живыми клетками, например, для изучения взаимодействия EGFR с его антагонистом49 или для отделения флуоресценции от белков, прикрепленных к вариантам eGFP с исключительно коротким и длительным сроком жизни флуоресценции50.

В то время как измерения FRET на основе PIE в очищенных белках в основном используются для изучения динамики белка3622,в живых клетках они сосредоточены на понимании белково-белковых взаимодействий. Этот подход был применен для изучения регуляции активности киназы MAP в дрожжах51 или для разрешения взаимодействия мембранных белков с их цитозольным партнером по связыванию, как кратко изложено в этой недавней статье52. Здесь осложнения могут возникнуть, когда значительные перекрестные помехи зеленых флуорофоров все еще присутствуют в окне времени задержки красных каналов или красный сигнал в зеленых каналах в окне подсказки времени. Первое может быть вызвано недостаточной задержкой красного импульса по отношению к зеленому импульсу, в то время как оба эффекта проистекают из слишком сильно перекрывающихся спектров возбуждения и излучения выбранных флуорофоров. Рекомендуется тщательно проверять соответствующие одиночные маркированные конструкции и корректировать ложноположительные амплитуды CCFPIE, особенно в ячейках, где автофлуоресценция с очень коротким сроком службы флуоресценции может быть еще одним осложняющим фактором22.

В заключение, описанный здесь подход FRET-FCS имеет большой потенциал для понимания белково-белковых взаимодействий и динамики белка в живых клетках при концентрациях, близких к физиологическим. В этом протоколе основное внимание уделялось требуемым калибровочным измерениям и необходимому количественному анализу, который должен быть выполнен во время измерений живых клеток. С этой целью были показаны различные измерения живых клеток, дополненные моделированием. Моделирование обеспечивает общее понимание здесь, поскольку параметр может систематически изменяться с помощью специализированных моделей соответствия, которые описывают конкретную мобильность и фотофизические свойства соответствующих данных. Анализ проводился с помощью программных средств с открытым исходным кодом с обширным пошаговым протоколом и простыми в адаптации шаблонами. Наконец, технические достижения и, следовательно, наличие готовых к покупке стабильных систем PIE-FCS вместе с распространением программного обеспечения с открытым исходным кодом для анализа данных сделают этот метод все более и более доступным для более широкого исследовательского сообщества, чтобы в конечном итоге разгадать белковое взаимодействие и динамику в живых клетках с самой высокой чувствительностью.

Disclosures

У авторов нет конфликтов, которые можно было бы декларировать.

Acknowledgments

Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, номер проекта 374031971, проект INF) для J.B. и K.G.H.

Мы благодарим Центр Рудольфа Вирхова за финансовую поддержку и Core Unit Fluorescence Imaging за техническую поддержку. Кроме того, мы благодарим Ашвина Балакришнана за тщательную корректуру.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) --- Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA --- tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) --- Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany --- Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany --- Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

Биохимия выпуск 178
Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hemmen, K., Choudhury, S.,… More

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter